Escherichia coli O157:H7 Kit de Detecção de Ácido Nucleico (Método de Sonda Fluorescente de PCR)
Descrição do kit:
Gato não.FP102
Ele é usado para detecção e triagem rápidas de E. coli O157:H7 em alimentos, rações, amostras de água e amostras ambientais.
Descrições
É usado para detecção e triagem rápida de E. coli O157:H7 em alimentos, rações, amostras de água e amostras ambientais.
[Princípio de teste]De acordo com o princípio da tecnologia de PCR fluorescente, primers específicos e sondas Taqman são projetados para o gene específico de Escherichia coli O157: H7, e detectados por um instrumento de PCR fluorescente, de modo a realizar a detecção de Escherichia coli O157: H7 Detecção qualitativa de DNA.
Conteúdo do kit
Observação: a sonda de canal ROX não está incluída.
| Ccomponentes | Especificação | Qquantidade |
| Tampão A | Tubo | 1 |
| Tampão B | Tubo | 1 |
| controle positivo | Tubo | 1 |
| Controle negativo | Tubo | 1 |
Uso esperado
É usado para detecção rápida e triagem de E. coli O157:H7 em alimentos, rações, amostras de água e amostras ambientais.
Condições de armazenamento e data de validade
Armazene a -20 ℃ no escuro e evite congelamentos e descongelamentos repetidos.
O período de validade é de 12meses, e a data de produção é mostrada na embalagem externa.
Instrumentos e consumíveis
Instrumento de PCR quantitativo fluorescente, pistola de pipeta e pontas correspondentes, agitador de vórtice, minicentrífuga.
Uso
1. Processamento de amostras
1.1 Tipo de amostra: Este kit é adequado para alimentos, rações, amostras de água e outras amostras suspeitas de estarem contaminadas por Escherichia coli O157:H7.Para produtos de processamento profundo de carne, bebidas e outras substâncias contendo pigmentos, eles precisam ser enxaguados para evitar afetar a coleta do sinal de fluorescência.
1.2 Processamento de amostras: Consulte "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" para preparação de amostras, cultura de enriquecimento e isolamento de Escherichia coli O157: H7.
- Nextração de ácido ucleico
Pegue 20 mL de solução de enriquecimento em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione 200 μL de lisado microbiano (kit adicional é necessário), vortex por 30 segundos, centrifugue brevemente e reserve.
Observações: A extração do ácido nucleico do lisado deve ser concluída em 10 minutos e não pode ser armazenado por muito tempo.
3. Amplificação de Ácido Nucleico
3.1 Ligue o instrumento PCR quantitativo fluorescente para uso.
Tampão A e Tampão B do kit, derreta-os completamente e centrifugue brevemente.Adicione 18 μL de tampão A e 2 μL de tampão B a cada tubo de reação de PCR.Em seguida, adicione 5 mL de cada controle negativo, ácido nucleico extraído e controle positivo em tubos de reação de PCR, tampe os tubos e centrifugue brevemente.
3.3 Transfira o tubo de reação de PCR para uma máquina de PCR fluorescente e use os seguintes procedimentos para realizar experimentos de amplificação: selecione 25 mL para o sistema de reação, colete sinais de fluorescência a 60°C para cada ciclo e selecione FAM para o canal de detecção.
| Etapa | Programa | Número de ciclos |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (coletar fluorescência) |
Guias para análise de problemas
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Nenhum RNA pode ser extraído ou o rendimento do ácido nucleico é baixo
Geralmente, existem muitos fatores que afetam a eficiência da recuperação, como: conteúdo de RNA da amostra, método de operação, volume de eluição, etc.。
Análise de causas comuns:
1. Banho de gelo ou centrifugação a baixa temperatura (4 ° C) durante a operação.
Sugestão: Operação em temperatura ambiente (15-25°C), nunca banho de gelo e centrifugação em baixa temperatura.
2. Armazenamento inadequado de amostras ou armazenamento de amostras por muito tempo.
Sugestão: Conservar as amostras a -80°C ou congelar em nitrogênio líquido, evitando o uso repetido de congelamento-descongelamento;tente usar amostras recém-colhidas para extração de RNA.
3. Lise de amostra insuficiente
Recomendação: Certifique-se de que a amostra e a solução de trabalho (Acrilamida Linear) foram bem misturadas e incubadas por 10 min em temperatura ambiente (15-25 ° C)
4. O eluente foi adicionado incorretamente
Recomendação: Certifique-se de que o ddH2O livre de RNase seja adicionado no meio da membrana da coluna de purificação
5.Volume impróprio de etanol anidro em Tampão viRW2
Sugestão: Siga as instruções, adicione o volume correto de etanol anidro ao Buffer viRW2 e misture bem antes de usar o kit。
6.Uso de amostra impróprio.
Sugestão: 200µl de amostra por 500µl de Tampão viRL.Volume de amostra excessivo resultará em taxa de extração de RNA reduzida.
7.Volume de eluição inadequado ou eluição incompleta.
Sugestão: O volume do eluente da coluna de purificação é de 30-50μl;se o efeito de eluição não for satisfatório, recomenda-se adicionar ddH livre de RNase pré-aquecido2O e estender o tempo de colocação à temperatura ambiente, como 5-10min
8. A coluna de purificação contém resíduos de etanol após a lavagem em Tampão viRW2.
Sugestão: Se o etanol ainda permanecer após a lavagem em Tampão viRW2 e centrifugação em tubo vazio por 2min, a coluna de purificação pode ser deixada em temperatura ambiente por 5min após a centrifugação em tubo vazio para remover totalmente o etanol restante.
A degradação de moléculas de RNA purificadas
A qualidade do RNA purificado está relacionada a fatores como armazenamento da amostra, contaminação por RNase e operação.
Análise de causas comuns:
1.As amostras coletadas não foram salvas a tempo.
Sugestão: Se a amostra não for usada a tempo após a coleta, armazene-a a -80 ℃ ou nitrogênio líquido imediatamente.Para a extração de moléculas de RNA, tente usar amostras recém-colhidas sempre que possível.
2.As amostras coletadas congelavam e descongelavam repetidamente.
Sugestão: Evite congelamentos e descongelamentos repetidos (não mais de uma vez) durante a coleta e armazenamento da amostra, caso contrário, o rendimento do ácido nucléico diminuirá.
3. RNase foi introduzida na sala de cirurgia ou não foram usadas luvas descartáveis, máscaras, etc.
Sugestão: O experimento de extração de moléculas de RNA é melhor realizado em uma sala de operação de RNA separada, e a mesa experimental é limpa antes do experimento.Use luvas e máscaras descartáveis durante o experimento para evitar a degradação do RNA causada pela introdução de RNase.
4.O reagente é contaminado por RNase durante o uso.
Sugestão: Substitua por um novo kit de isolamento de RNA viral para experimentos relacionados.
5. A contaminação por RNase dos tubos de centrífuga, ponteiras de pipetas, etc. Sugestão: Certifique-se de que os tubos de centrífuga, ponteiras de pipetas e pipetas estejam livres de RNase.
As moléculas de RNA purificadas afetaram os experimentos a jusante
As moléculas de RNA purificadas pela coluna de purificação afetarão os experimentos a jusante se houver muitos íons salinos ou proteínas, como: transcrição reversa, Northern Blot, etc.。
1.Existem íons salinos remanescentes nas moléculas de RNA eluídas.
Recomendação: Certifique-se de que o volume correto de etanol anidro foi adicionado ao tampão viRW2 e lave a coluna de purificação duas vezes de acordo com a velocidade de centrifugação correta nas instruções de operação; Se ainda houver íons salinos restantes, você pode adicionar tampão viRW2 à coluna de purificação e deixá-la em temperatura ambiente por 5 minutos.Em seguida, realize a centrifugação para remover a contaminação de íons de sal ao máximo
2. Há etanol remanescente nas moléculas de RNA eluídas
Sugestão: uma vez confirmado que as colunas de purificação foram enxaguadas pelo Buffer viRW2, realize a centrifugação em tubo vazio de acordo com a velocidade de centrifugação nas instruções de operação.Se ainda houver etanol restante, ele pode ser deixado por 5 minutos em temperatura ambiente após uma centrifugação em tubo vazio para remover o etanol restante ao máximo.
Manual de instruções:
Manual de instruções do kit de isolamento de RNA viral
