Explicação dos termos básicos da biologia molecular
1. cDNA e cccDNA: o cDNA é um DNA de fita dupla sintetizado pela transcriptase reversa a partir do mRNA;cccDNA é um plasmídeo de DNA circular fechado de fita dupla livre do cromossomo.
2. Unidade de dobramento padrão: a unidade de estrutura secundária da proteína α-hélice e β-folha podem formar blocos estruturais com arranjos geométricos especiais através de vários polipeptídeos de conexão.Esse tipo de dobramento determinado costuma ser chamado de estrutura supersecundária.Quase todas as estruturas terciárias podem ser descritas por esses tipos de dobras e até mesmo seus tipos combinados, por isso também são chamadas de unidades de dobra padrão.
3. CAP: proteína receptora de monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) CRP (proteína receptora de cAMP), o complexo formado após a combinação de cAMP e CRP é chamado de proteína ativadora CAP (proteína ativada por cAMP)
4. Sequência palindrômica: A sequência complementar reversa de um segmento de um fragmento de DNA, geralmente um sítio de enzima de restrição.
5. micRNA: RNA interferente complementar ou RNA antisense, que é complementar à sequência do mRNA e pode inibir a tradução do mRNA.
6. Ribozima: RNA com atividade catalítica, que desempenha papel autocatalítico no processo de splicing do RNA.
7. Motivo: Existem algumas regiões locais com forma tridimensional e topologia semelhantes na estrutura espacial das moléculas de proteína
8. Peptídeo sinal: um peptídeo com 15-36 resíduos de aminoácidos no terminal N durante a síntese protéica, que guia a transmembrana da proteína.
9. Atenuador: Uma sequência de nucleotídeos entre uma região operadora e um gene estrutural que termina a transcrição.
10. Ponto Mágico: Quando a bactéria cresce e encontra uma completa falta de aminoácidos, a bactéria produzirá uma resposta de emergência para interromper a expressão de todos os genes.Os sinais que geram essa resposta de emergência são guanosina tetrafosfato (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp).O papel de PpGpp e pppGpp não é apenas um ou alguns operons, mas afeta um grande número deles, por isso são chamados de super-reguladores ou pontos mágicos.
11. Elemento promotor upstream: refere-se à sequência de DNA que desempenha um papel regulador na atividade do promotor, como TATA na região -10, TGACA na região -35, intensificadores e atenuadores.
12. Sonda de DNA: um segmento marcado de DNA com uma sequência conhecida, que é amplamente utilizado para detectar sequências desconhecidas e rastrear genes-alvo.
13. Sequência SD: É a sequência de ligação do ribossomo e do mRNA, que regula a tradução.
14. Anticorpo Monoclonal: Um anticorpo que age apenas contra um único determinante antigênico.
15. Cosmídeo: É um vetor de DNA exógeno construído artificialmente que retém as regiões COS em ambas as extremidades do fago e é conectado ao plasmídeo.
16. Triagem de mancha azul-branca: gene LacZ (que codifica β-galactosidase), a enzima pode decompor o substrato cromogênico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indole-β-D-galactosídeo) para produzir azul, tornando a cepa azul.Quando o DNA exógeno é inserido, o gene LacZ não pode ser expresso e a cepa é branca, para rastrear a bactéria recombinante.Isso é chamado de triagem azul-branco.
17. Elemento de ação cis: Uma sequência específica de bases no DNA que regula a expressão gênica.
18. Enzima de Klenow: Grande fragmento da DNA polimerase I, exceto que a atividade da exonuclease 5' 3' é removida da holoenzima da DNA polimerase I
19. PCR ancorado: usado para amplificar o DNA de interesse com uma sequência conhecida em uma extremidade.Uma cauda poli-dG foi adicionada a uma extremidade da sequência desconhecida e, em seguida, o poli-dC e a sequência conhecida foram usados como iniciadores para amplificação por PCR.
20. Proteína de fusão: O gene da proteína eucariótica está conectado com o gene exógeno, e a proteína composta da tradução da proteína do gene original e da proteína exógena é expressa ao mesmo tempo.
Outros termos de biologia molecular
1. O mapa físico do DNA é a ordem na qual os fragmentos (digeridos pela endonuclease de restrição) da molécula de DNA são arranjados.
2. A clivagem da RNase é dividida em dois tipos (autocatálise) e (heterocatálise).
3. Existem três fatores de iniciação em procariotos são (IF-1), (IF-2) e (IF-3).
4. As proteínas transmembrana requerem orientação (peptídeos de sinal), e o papel das chaperonas de proteína é (ajuda a dobrar a cadeia peptídica na conformação nativa da proteína).
5. Os elementos nos promotores geralmente podem ser divididos em dois tipos: (elementos do núcleo do promotor) e (elementos do promotor a montante).
6. O conteúdo de pesquisa da biologia molecular inclui principalmente três partes: (biologia molecular estrutural), (expressão e regulação gênica) e (tecnologia de recombinação de DNA).
7. Os dois principais experimentos que demonstram que o DNA é o material genético são (infecção por pneumococo de camundongos) e (infecção por fago T2 de Escherichia coli).potencial).
8. Existem duas diferenças principais entre hnRNA e mRNA: (hnRNA é emendado no processo de conversão em mRNA), (a extremidade 5' do mRNA é adicionada com uma tampa m7pGppp e há uma poliadenilação extra na extremidade 3' da cauda do ácido mRNA (polyA).
9. As vantagens da forma multi-subunidade da proteína são (a subunidade é um método econômico para a utilização do DNA), (pode reduzir o impacto de erros aleatórios na síntese de proteínas na atividade da proteína), (a atividade pode ser muito eficiente e rapidamente aberta e fechada).
10. O conteúdo principal da teoria da primeira nucleação do mecanismo de enovelamento de proteínas inclui (nucleação), (enriquecimento estrutural), (rearranjo final).
11. A galactose tem um duplo efeito sobre as bactérias;por um lado (pode ser usado como fonte de carbono para crescimento celular);por outro lado (é também um componente da parede celular).Portanto, um promotor S2 independente de cAMP-CRP é necessário para a síntese permanente no nível de fundo;ao mesmo tempo, um promotor S1 dependente de cAMP-CRP é necessário para regular a síntese de alto nível.A transcrição começa de (S2) com G e de (S1) sem G.
12. A tecnologia do DNA recombinante também é conhecida como (clonagem de genes) ou (clonagem molecular).O objetivo final é (transferir o DNA da informação genética de um organismo para outro organismo).Um experimento típico de recombinação de DNA geralmente inclui as seguintes etapas: (1) Extrair o gene alvo (ou gene exógeno) do organismo doador e conectá-lo enzimaticamente a outra molécula de DNA (vetor de clonagem) para formar uma nova molécula de DNA recombinante.② A molécula de DNA recombinante é transferida para a célula receptora e replicada na célula receptora.Esse processo é chamado de transformação.③ Rastreie e identifique as células receptoras que absorveram o DNA recombinante.④Cultive as células contendo DNA recombinante em grandes quantidades para detectar se o gene auxiliar externo é expresso.
13. Existem dois tipos de replicação de plasmídeo: aqueles que são estritamente controlados pela síntese de proteínas da célula hospedeira são chamados (plasmídeos rígidos) e aqueles que não são estritamente controlados pela síntese de proteínas da célula hospedeira são chamados (plasmídeos relaxados).
14. O sistema de reação de PCR deve atender às seguintes condições: a.Primers de DNA (cerca de 20 bases) com sequências complementares em cada extremidade das duas fitas do gene alvo a serem separadas.b.Enzimas com estabilidade térmica como: TagDNA polimerase.c, dNTPd, sequência de DNA de interesse como modelo
15. O processo básico de reação da PCR inclui três etapas: (desnaturação), (recozimento) e (extensão).
16. O processo básico de animais transgênicos geralmente inclui: ①Introdução de gene estranho clonado no núcleo de um óvulo fertilizado ou célula-tronco embrionária;②Transplante do ovo fertilizado inoculado ou célula-tronco embrionária no útero feminino;③Desenvolvimento e crescimento embrionário completo Para a prole com genes estranhos;④ Use esses animais que podem produzir proteínas estranhas como reprodutores para criar novas linhagens homozigóticas.
17. As linhas celulares de hibridoma são geradas por hibridização de células (baço B) com células (mieloma), e uma vez que (células do baço) podem utilizar hipoxantina e (células ósseas) fornecem funções de divisão celular, elas podem ser cultivadas em meio HAT.crescer.
18. Com o aprofundamento das pesquisas, a primeira geração de anticorpos é denominada (anticorpos policlonais), a segunda geração (anticorpos monoclonais) e a terceira geração (anticorpos de engenharia genética).
19. Atualmente, a engenharia genética de vírus de insetos está focada principalmente no baculovírus, que se manifesta na introdução de (gene da toxina exógena);(genes que perturbam o ciclo de vida normal dos insetos);(modificação dos genes do vírus).
20. Os fatores de proteína de ação trans correspondentes aos elementos comuns TATA, GC e CAAT no promotor da RNA polimerase II de mamífero são (TFIID), (SP-1) e (CTF/NF1), respectivamente.
vinte e um.Os fatores básicos de transcrição da RNA polimerase Ⅱ são, TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, e sua sequência de ligação é: (D, A, B, E).Em que a função de TFII-D é (ligação à caixa TATA).
vinte e dois.A maioria dos fatores de transcrição que se ligam ao DNA funcionam na forma de dímeros.Os domínios funcionais dos fatores de transcrição que se ligam ao DNA são comumente os seguintes (hélice-volta-hélice), (motivo dedo de zinco), (leucina básica) motivo de zíper).
vinte e três.Existem três tipos de modos de clivagem de endonuclease de restrição: (corte no lado 5' do eixo de simetria para gerar extremidades adesivas 5'), (corte no lado 3' do eixo de simetria para gerar extremidades adesivas 3' (corte no eixo de simetria para gerar segmentos planos).
vinte e quatro.O DNA plasmidial tem três configurações diferentes: (configuração SC), (configuração oc), (configuração L).A primeira em eletroforese é (configuração SC).
25. Sistemas de expressão gênica exógena, principalmente (Escherichia coli), (Levedura), (Inseto) e (tabela de células de mamíferos).
26. Os métodos comumente usados para animais transgênicos são: (método de infecção retroviral), (método de microinjeção de DNA), (método de células-tronco embrionárias).
Aplicação Biologia molecular
1. Cite as funções de mais de 5 RNAs?
RNA tRNA de transferência Aminoácido de transferência RNA ribossômico rRNA O ribossomo constitui o RNA mensageiro mRNA Molde de síntese proteica RNA nuclear heterogêneo hnRNA Precursor do mRNA maduro pequeno RNA nuclear snRNA Envolvido no splicing do hnRNA RNA citoplasmático pequeno proteína scRNA/7SL-RNA Componentes corporais de reconhecimento de sinais sintetizados e localizados no retículo plasmático RNA antisense anRNA/micRNA Regula a expressão gênica RNA ribozima RNA enzimaticamente ativo
2. Qual é a principal diferença entre promotores procarióticos e eucarióticos?
TTGACA Procariótico --- TATAAT------Sítio de Iniciação-35 -10 Intensificador Eucariótico---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Sítio de Iniciação-110 -70 -25
3. Quais são os principais aspectos da construção artificial de plasmídeos naturais?
Os plasmídeos naturais geralmente apresentam defeitos, portanto, não são adequados para uso como portadores de engenharia genética e devem ser modificados e construídos: a.Adicione genes marcadores de seleção adequados, como dois ou mais, que são fáceis de usar para seleção, geralmente genes antibióticos.b.Aumente ou diminua os locais adequados de corte de enzimas para facilitar a recombinação.c.Reduza o comprimento, corte fragmentos desnecessários, melhore a eficiência de importação e aumente a capacidade de carga.d.Mude o replicon, de apertado para solto, de menos cópias para mais cópias.e.Adicione elementos genéticos especiais de acordo com os requisitos especiais de engenharia genética
4. Dê um exemplo de método para triagem diferencial de cDNA tecido-específico?
Duas populações de células são preparadas, o gene alvo é expresso ou altamente expresso em uma das células, e o gene alvo não é expresso ou é pouco expresso na outra célula, e então o gene alvo é encontrado por hibridação e comparação.Por exemplo, durante a ocorrência e desenvolvimento de tumores, as células tumorais apresentarão mRNAs com níveis de expressão diferentes das células normais.Portanto, os genes relacionados ao tumor podem ser rastreados por hibridação diferencial.O método de indução também pode ser usado para rastrear os genes cuja expressão é induzida.
5. Geração e triagem de linhas celulares de hibridoma?
Células B do baço + células do mieloma, adicione polietilenoglicol (PEG) para promover a fusão celular, e as células de fusão do baço B-mieloma cultivadas em meio HAT (contendo hipoxantina, aminopterina, T) continuam a se expandir nutrir.A fusão celular contém: células de fusão baço-baço: incapazes de crescer, as células do baço não podem ser cultivadas in vitro.Células de fusão osso-osso: não podem utilizar hipoxantina, mas podem sintetizar purina através da segunda via usando folato redutase.A aminopterina inibe a folato redutase e, portanto, não pode crescer.Células de fusão osso-baço: podem crescer em HAT, as células do baço podem utilizar hipoxantina e as células ósseas fornecem a função de divisão celular.
6. Qual é o princípio e o método de determinação da estrutura primária do DNA pelo método de terminação didesoxi (método de Sanger)?
O princípio é usar um terminador de cadeia de nucleotídeos - 2,,3,-didesoxinucleotídeo para terminar a extensão do DNA.Uma vez que não possui o 3-OH necessário para a formação de ligações 3/5/fosfodiéster, uma vez incorporada à cadeia de DNA, a cadeia de DNA não pode ser mais estendida.De acordo com o princípio do pareamento de bases, sempre que a DNA polimerase necessitar do dNMP para participar da cadeia de DNA normalmente estendida, existem duas possibilidades, uma é participar do ddNTP, que resulta no término da extensão da cadeia desoxinucleotídica;a outra é participar do dNTP, de modo que a cadeia de DNA ainda possa continuar a se estender até que o próximo ddNTP seja incorporado.De acordo com este método, pode ser obtido um grupo de fragmentos de DNA de diferentes comprimentos terminando em ddNTP.O método é dividir em quatro grupos, respectivamente, ddAMP, ddGMP, ddCMP e ddTMP.Após a reação, a eletroforese em gel de poliacrilamida pode ler a sequência de DNA de acordo com as bandas de natação.
7. Qual é o efeito de regulação positiva da proteína ativadora (CAP) na transcrição?
Proteína receptora de adenilato cíclico (cAMP) CRP (cAMP receptor protein), o complexo formado pela combinação de cAMP e CRP é denominado CAP (cAMPactivated protein).Quando a E. coli é cultivada em meio sem glicose, a síntese de CAP aumenta, e CAP tem a função de ativar promotores como a lactose (Lac).Alguns promotores dependentes de CRP não possuem o típico recurso de sequência da região -35 (TTGACA) que os promotores comuns possuem.Portanto, é difícil para a RNA polimerase se ligar a ele.A presença de CAP (função): pode melhorar significativamente a constante de ligação da enzima e do promotor.Ele mostra principalmente os dois aspectos a seguir: ① CAP ajuda a molécula da enzima a se orientar corretamente, alterando a conformação do promotor e a interação com a enzima, de modo a combinar com a região -10 e desempenhar o papel de substituir a função da região -35.②CAP também pode inibir a ligação da RNA polimerase a outros sítios no DNA, aumentando assim a probabilidade de ligação ao seu promotor específico.
8. Quais etapas são geralmente incluídas em um experimento típico de recombinação de DNA?
a.Extraia o gene alvo (ou gene exógeno) do organismo doador e conecte-o enzimaticamente a outra molécula de DNA (vetor de clonagem) para formar uma nova molécula de DNA recombinante.b.Transfira a molécula de DNA recombinante para a célula receptora e replique-a e preserve-a na célula receptora.Esse processo é chamado de transformação.c.Rastreie e identifique as células receptoras que absorveram o DNA recombinante.d.Cultive em massa as células contendo o DNA recombinante para detectar se o gene auxiliar externo é expresso.
9. Construção da biblioteca de genes Três métodos para triagem de recombinantes são apresentados e o processo é brevemente descrito.
Triagem de resistência a antibióticos, inativação insercional de resistência, triagem de mancha azul-branca ou triagem de PCR, triagem diferencial, sonda de DNA A maioria dos vetores de clonagem carrega genes de resistência a antibióticos (anti-ampicilina, tetraciclina).Quando o plasmídeo é transferido para Escherichia coli, a bactéria vai adquirir resistência, e aquelas sem transferência não terão resistência.Mas não pode distinguir se foi reorganizado ou não.Em um vetor contendo dois genes de resistência, se um fragmento de DNA estranho for inserido em um dos genes e fizer com que o gene seja inativado, duas placas de controle contendo drogas diferentes podem ser usadas para rastrear recombinantes positivos.Por exemplo, o plasmídeo pUC contém o gene LacZ (que codifica β-galactosidase), que pode decompor o substrato cromogênico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indole-β-D-galactosídeo) para produzir azul, tornando assim a cepa azul.Quando o DNA estranho é inserido, o gene LacZ não pode ser expresso e a cepa é branca, de modo a rastrear as bactérias recombinantes.
10. Explique o processo básico de obtenção de animais transgênicos por meio de células-tronco embrionárias?
As células-tronco embrionárias (TE) são células embrionárias durante o desenvolvimento embrionário, que podem ser cultivadas e proliferadas artificialmente e têm a função de se diferenciar em outros tipos de células.Cultura de células ES: A massa celular interna do blastocisto é isolada e cultivada.Quando o ES é cultivado em uma camada sem alimentador, ele se diferencia em várias células funcionais, como células musculares e células N.Quando cultivada em meio contendo fibroblastos, a ES manterá a função de diferenciação.O ES pode ser manipulado geneticamente e sua função de diferenciação pode ser integrada sem afetar sua função de diferenciação, o que resolve o problema da integração aleatória.Introduzir genes exógenos em células-tronco embrionárias, depois implantar no útero de camundongos fêmeas grávidas, desenvolver filhotes e cruzar para obter camundongos homozigotos.
