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Descrições

Este kit usa um sistema de tampão de lise exclusivo que pode liberar rapidamente o RNA de amostras de células cultivadas para reações de RT-qPCR, eliminando assim o demorado e trabalhoso processo de purificação de RNA.O modelo de RNA pode ser obtido em apenas 7 minutos.Os reagentes 5×Direct RT Mix e 2×Direct qPCR Mix-SYBR fornecidos pelo kit podem obter resultados de PCR quantitativos em tempo real de forma rápida e eficaz.

5×Direct RT Mix e 2×Direct qPCR Mix-SYBR têm forte tolerância a inibidores, e o lisado das amostras pode ser usado como modelo para RT-qPCR diretamente.Este kit contém a exclusiva transcriptase reversa Foregene de alta afinidade de RNA e polimerase de DNA Hot D-Taq, dNTPs, MgCl₂, tampão de reação, otimizador e estabilizador de PCR.

Especificações

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Componentes do kit

Características&vantagens

■ Simples e eficaz: com a tecnologia Cell Direct RT, amostras de RNA podem ser obtidas em apenas 7 minutos.

■ A demanda de amostra é pequena, apenas 10 células podem ser testadas.

■ Alto rendimento: pode detectar rapidamente o RNA em células cultivadas em placas de 384, 96, 24, 12, 6 poços.

■ O DNA Eraser pode remover rapidamente os genomas liberados, reduzindo bastante o impacto nos resultados experimentais subseqüentes.

■ O sistema otimizado de RT e qPCR torna a transcrição reversa de RT-PCR de duas etapas mais eficiente e a PCR mais específica e mais resistente aos inibidores da reação de RT-qPCR.

Kit de aplicação

Âmbito de aplicação: células cultivadas.

- ARN libertado por lise da amostra: aplicável apenas ao modelo RT-qPCR deste kit.

- O kit pode ser utilizado para as seguintes finalidades: análise de expressão gênica, verificação do efeito de silenciamento gênico mediado por siRNA, triagem de drogas, etc.

Diagrama

Armazenamento e prazo de validade

A parte I deste kit deve ser armazenada a 4℃;A Parte II deve ser armazenada a -20℃.

Foregene Protease Plus II deve ser armazenado a 4 ℃, não congelar a -20 ℃.

Reagente 2×Direct qPCR Mix-SYBR deve ser armazenado a -20℃ no escuro;se usado com frequência, também pode ser armazenado a 4 ℃ para armazenamento de curto prazo (use em 10 dias). Somos fabricantes experientes.Ganhando a maioria nas certificações cruciais de seu mercado para grandes descontos China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, qualidade é vida de fábrica, foco na demanda do cliente é a fonte de sobrevivência e desenvolvimento da empresa, aderimos à honestidade e atitude de trabalho de boa fé, ansiosos pela sua vinda!
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QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Para RT-qPCR direto da célula usando ≤ 1.000.000 células

Introdução do produto

Este produto usa um sistema de tampão de lise exclusivo para liberar rapidamente o RNA de amostras de células cultivadas para reações de RT-qPCR, eliminando o demorado e trabalhoso processo de purificação de RNA, e apenas 7 minutos para obter o modelo de RNA necessário, com o 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman fornecido pelo kit pode obter resultados de PCR quantitativos em tempo real de forma rápida e eficiente.

5× Direct RT Mix e 2× Direct qPCR Mix-Taqman têm forte tolerância a inibidores e podem realizar reversão eficiente e amplificação específica usando o lisado da amostra a ser medida como modelo.O reagente contém Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, que pode ser usado com tampão de lise para detectar amostras de forma rápida e fácil, e possui as características de alta sensibilidade, especificidade e estabilidade.

Características do produto

Tecnologia Cell Direct RT simples e eficaz que leva apenas 7 minutos para obter amostras de RNA.

Os requisitos de amostra são pequenos e um mínimo de 10 células cultivadas podem ser usadas para experimentação.

Alto rendimento para aquisição rápida de RNA de células cultivadas, como placas de 384, 96, 24, 12 e 6 poços.

O DNA Eraser é capaz de remover rapidamente os genomas liberados, reduzindo bastante o impacto nos resultados experimentais subsequentes.

Os sistemas otimizados de RT e qPCR permitem RT-PCR de duas etapas com transcrição reversa mais eficiente, especificidade e tolerância mais forte ao inibidor de reação de RT-qPCR.

Kit de aplicação

Âmbito de aplicação: Células cultivadas.

RNA interpretado por lise de amostra: usado apenas como um modelo de RT-qPCR de duas etapas.

Os kits podem ser usados ​​para as seguintes finalidades: análise de expressão regulatória de genes, teste de alelos, triagem de drogas, etc.

Limitações do kit

Fragmentos amplificados ≤ 300 pb.

Os kits são usados ​​para células recém cultivadas.

Controle de qualidade do produto

De acordo com o Sistema de Gerenciamento de Qualidade Total da FOREGENE, cada lote de kits da série Cell Direct RT-qPCR é rigorosamente testado várias vezes para garantir a confiabilidade e a estabilidade da qualidade de cada lote de kits.

Conteúdo do kit

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman podem ser adquiridos separadamente, os detalhes são fornecidos no Apêndice 1 (PÁGINA 13).

Condições de armazenamento

1. Condições de envio

Todo o processo de transporte da caixa de gelo a baixa temperatura, para garantir que o kit esteja no estado <4 °C.

2. Condições de armazenamento

Armazenar a Parte I a 4°C e a Parte II a -20°C.

O Foregene Protease Plus II deve ser armazenado a 4°C, não congelado a -20°C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman é armazenado a -20°C ou a 4°C para uso de curto prazo se usado com frequência (dentro de 10 dias).

Informações do componente do kit

Buffer CL: Fornece o ambiente necessário para as reações de lise celular.

Buffer ST: Termina a substância ativa no lisado para evitar efeitos na RT subsequente.

Apagador de DNA: removedor de DNA, o efeito de remover o genoma em experimentos subsequentes.

5× Direct RT Mix: Contém alta afinidade de RNA Foregene Reverse Transcriptase, inibidor de RNase, dNTPs, estabilizadores, intensificadores, otimizadores e primers de transcrição reversa para alinhamento ideal (Random Primer, Oligo(dT)₁₈primário).

Foregene Protease Plus II: No contexto do tampão de lise, as células são lisadas para liberar ácidos nucleicos.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Este reagente contém Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, tampão de reação, otimizador de PCR e estabilizador.

Corante de referência 20× ROX: Geralmente usado em instrumentos de amplificação de PCR em tempo real da ABI, Stratagene e outras empresas, é usado para ajustar a diferença entre tubos de PCR e tubos causados ​​por erros de dosagem de PCR.A concentração de 20× ROX Reference Dye necessária para diferentes instrumentos é diferente, e o usuário pode adicioná-la de acordo com a concentração recomendada do instrumento.

RNase-Free ddH₂O: Água ultrapura esterilizada livre de RNase para reações de RT-qPCR em duas etapas.

Precauções:(Certifique-se de ler atentamente as precauções antes de usar o kit)

Preste atenção ao método de operação do experimento para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.

Preste atenção à limpeza do ambiente experimental e utensílios para evitar contaminação RNase e degradação do RNA.

Pegue amostras de células frescas ou bem preservadas e nunca use amostras de células congeladas e descongeladas repetidas.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman deve evitar congelamento-descongelamento repetido, caso contrário, afetará a transcrição reversa e a eficiência do PCR.

PreparaçõesantesOperação

Certifique-se de ler as instruções cuidadosamente antes de usar este kit.O kit Cell Direct RT-qPCR é simples, conveniente e rápido de operar, e as instruções fornecem informações completas sobre todo o kit e como usá-lo corretamente.Por favor, prepare os materiais e equipamentos experimentais necessários antes de usar.

Materiais e equipamentos experimentais

◆ Células de cultura.

◆ 1,5 ml ou 2 ml, tubo de centrífuga RNase-/DNase-Free, ponta RNase-/DNase-Free, tubo qPCR estéril de 0,2 ml.

◆ máquina qPCR, pipeta, centrífuga de mesa (≥13.400×g) (dependendo das necessidades experimentais), etc.

Segurança

◆ Este produto destina-se apenas a fins de pesquisa científica, não o utilize para fins farmacêuticos, clínicos, alimentares e cosméticos.

◆ Ao usar produtos químicos, use roupas de laboratório apropriadas, luvas, óculos de proteção, etc.

Operaçãoguias

Sistemas de lise celular, sistemas de RT e pacotes suplementares de solução de reação qPCR podem ser adquiridos separadamente, para obter detalhes no Apêndice 1 (PÁGINA 13).

Guia de operação

A: Liberação de amostra de RNA

1. As células foram pré-tratadas: lave a placa de cultura celular com PBS frio e, em seguida, lise as células (10-10⁶), 10⁶ do que a quantidade de células, é recomendado Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ou Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) para extração e purificação de RNA.

1.1.Células aderentes (placa de 24 poços como exemplo)

1.1.1.Determine o número de células em cada poço, determine que o número de células é 1 × 10⁵, e use uma pipeta para remover o meio de cultura da placa de cultura.

1.1.2.Adicione 200 μl de 1 × PBS pré-resfriado a cada poço.Não pipete repetidamente e remova o PBS dos poços.Incline a placa e remova o máximo possível de PBS.Prossiga para a etapa 2.

1.1.3.Placa de cultura de células diferente ou uma tabela de número de referência 1-1 em uma placa de cultura de células foi adicionada pré-resfriada 1 × PBS para lavagem celular.

Tabela 1-1: Dosagem de PBS para diferentes números de células

Observação：Para garantir células aderentes firmes,um grande número de perda de células evitada durante a lavagem.

1.2.Células em suspensão ou células aderentes cultivadas em placas não porosas

1.2.1.Células aderentes cultivadas em placas não multipoços (células em suspensão começam a partir da próxima etapa 1.2.2), coletar e separar as células de acordo com o método normal de coleta de células e colocá-las em uma placa de cultura ou tubo de centrífuga;se a tripsinização for usada, requer centrifugação para coletar as células e remover tripsina residual, adicionou células ressuspensas em PBS em células individuais para dispersar as células.

1.2.2.Após o número de células contadas, as células aliquotadas 1 × 10⁵ um para tubos de centrifugação, coletar células por centrifugação a 1000 × g por 10 min.

1.2.3.Adicione 200 ul de PBS ao tubo da centrífuga, não pipete repetidamente e aspire diretamente o PBS.prossiga para a etapa 2. (Se for difícil precipitar e as células forem ressuspensas novamente, pode ser realizada centrifugação de 1000 × g 10 min após descartar o sobrenadante, o sedimento celular prossiga para a etapa 2)

2. Lise celular: Remover Buffer CL, sua temperatura equilibrada à temperatura ambiente, DNA Eraser e Foregene Protease Plus II, de acordo com o seguinte sistema de lise preparado na tabela 1-2: (A solução de lise está pronta para uso).

Tabela 1-2: clivagem preparação do sistema (Nota: na preparação no gelo)

3. (placa de 24 poços como exemplo) Pipetar 200 μl da mistura principal de lise celular em cada poço, soprar repetidamente 5-10 vezes, incubar à temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 5 min.

Observação：Para evitar a formação de bolhas, por favor, ao pipetar, a escala da pipeta foi ajustada para 200μl ou menos.As células podem parecer turvas após a lise, o que é normal.

4. (placa de 24 poços como exemplo) é adicionado no líquido 20 μl de tampão ST (diferentes sistemas de lise Tampão ST adicionado em uma quantidade mostrada na Tabela 1-3), pipetagem repetida 5-10 vezes, em temperatura ambiente (20-25 ℃) foram incubados por 2 min.

Observação：A ponta da pipeta disposta abaixo da superfície, garantindo que o lisado foi adicionado,para evitar a formação de bolhas, por favor, ao pipetar, a escala da pipeta foi ajustada para 200μl ou menos.

Tabela 1-3：Adicionar Buffer ST

5. O lisado é usado para experimentos de RT-qPCR subsequentes.Se os experimentos subsequentes não puderem ser realizados a tempo, mantenha-o no gelo por não mais que 2 horas e armazene a -20 ℃ ou -80 ℃ (não mais que três meses).

B: preparação do sistema RT

1. Retire 5 × Direct RT Mix e coloque em um banho de gelo, deixe derreter naturalmente e misture delicadamente para uso posterior;retire o ddH2O livre de RNase e derreta-o e coloque-o em um banho de gelo para uso posterior.Prepare o sistema de reação no gelo de acordo com a Tabela 2-1 abaixo.

Tabela 2-1: Preparação do sistema de reação RT

2.Após a conclusão da formulação do sistema, misture suavemente e centrifugue brevemente na seguinte tabela 2 -2 condições de reação RT reação.

Tabela 2-2: Configuração da condição de reação de RT

3. Após a conclusão da reação, o produto da reação foi colocado diretamente no gelo para qPCR, coloque a preservação a longo prazo -20 ℃ ou -80 ℃.

Observação: devido ao uso de modelo não purificado, podem aparecer precipitados brancos no produto de transcrição reversa.Este é um fenômeno normal.Centrifugue o sobrenadante imediatamente para experimentos subseqüentes.

A solução de reação de RT resultante é adicionada ao próximo passo Sistemas de reação de PCR em tempo real, recomenda-se adicionar quantidades que variam de 10 a 30% do sistema de reação.

C: preparação do sistema de reação qPCR

1. Quantidade apropriada de B preparada na etapa do modelo de cDNA de acordo com a tabela 3-1 a seguir para preparar um sistema de reação.

Nota: A quantidade de modelos de cDNA representa 10-30% do sistema qPCR.Por exemplo, em um sistema qPCR de 20μl, adicione 2-6 μl de tampão de lise, mas não mais que 6 μl.

2. A otimização de boas condições de qPCR (temperatura de recozimento, etc.) para a reação de qPCR (as condições de reação fornecidas na Tabela 3-2).

Nota: Tente usar condições otimizadas para reações qPCR para obter melhores resultados.

Tabela 3-1: Preparação do sistema de reação de PCR

1*: A concentração do primer pode ser ajustada na faixa de 50-900 nM quando o desempenho da reação do primer é ruim.

Nota: O sistema qPCR pode ser ajustado de acordo com as necessidades experimentais e o modelo do ciclador de fluorescência.Para qPCR em 50μl, ajuste a dosagem de reagente proporcionalmente de acordo com os 20μl sistema.

2*: Selecione a concentração final apropriada do ROX Reference Dye de acordo com o termociclador quantitativo de fluorescência.As concentrações de corante de referência ROX mais apropriadas para cicladores quantitativos de fluorescência comuns são mostradas na tabela abaixo:

Tabela 3-2: as condições de reação qPCR são fornecidas

Nota: Para obter o melhor efeito de qPCR, o gradiente de PCR pode ser usado para otimizar as condições de reação para diferentes modelos e diferentes primers.As condições de reação de PCR variam dependendo do analisador de fluorescência, modelo, primer, etc. Na operação específica, as condições de reação ideais precisam ser projetadas de acordo com as condições específicas do termociclador quantitativo de fluorescência, tipo de modelo, tamanho do fragmento de interesse, sequência de base do fragmento amplificado e conteúdo de GC e comprimento dos primers, incluindo temperatura de recozimento, tempo de reação, etc.

Princípios de design de primers de PCR em tempo real

Forward Primer e Reverse Primer

Para PCR em tempo real, o design do primer é muito importante.Os primers estão relacionados à especificidade e eficiência da amplificação por PCR e podem ser projetados com referência aos seguintes princípios:

◆ Comprimento do primer: 18-30bp.

◆ Conteúdo de GC: 40-60%.

◆ Valor Tm: O software de design do primer, como o Primer 5, pode fornecer o valor Tm do primer.Os valores de Tm dos primers upstream e downstream devem ser os mais próximos possíveis.A fórmula de cálculo Tm também pode ser usada: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Ao realizar PCR, uma temperatura abaixo do valor Tm do primer de 5 °C é geralmente selecionada como a temperatura de anelamento (o aumento correspondente na temperatura de anelamento pode aumentar a especificidade da reação de PCR).

◆ Primers e produtos de PCR:

◆ O comprimento do produto de amplificação por PCR do primer de design é de preferência 100-150bp.

◆ Os primers de design na área estrutural secundária do gabarito devem ser evitados tanto quanto possível.

◆ Evitar a formação de 2 ou mais bases complementares entre as extremidades 3' dos primers upstream e downstream.

◆ A base do terminal Primer 3' não pode estar presente com 3 G ou C consecutivos adicionais.

◆ Os próprios primers não podem ter estruturas complementares, caso contrário forma-se uma estrutura em gancho, afetando a amplificação por PCR.

◆ ATCG deve ser distribuído o mais uniformemente possível na sequência do primer, e a base 3' terminal deve ser evitada como T.

Apêndice1：Cell diretoRT-qPCR Kit de componentest pacote de suplemento

1.Solução de Lise Celular