Esterilização de pontas de pipetas e tubos EP, etc.
1. Preparar 0,1% (um milésimo) de DEPC (substância altamente tóxica) com água deionizada, utilizar com cuidado em capela de exaustão e armazenar a 4°C ao abrigo da luz;
A água DEPC é água pura tratada com DEPC e esterilizada por alta temperatura e alta pressão.Testado para ser livre de RNase, DNase e proteinase.
2. Coloque a ponta da pipeta e o tubo EP em 0,1% DEPC e certifique-se de que a ponta da pipeta e o tubo EP estejam preenchidos com 0,1% DEP.
3. Proteger da luz, deixar repousar durante a noite (12-24h)
4. A caixa contendo o tip e o tubo EP não precisa ser embebida em DEPC.Após retirar grosseiramente a água DEPC do bico ou tubo EP, embale-o e enrole-o.
5. 121 graus Celsius, 30min
6. 180 graus Celsius, seco por várias horas (pelo menos 3 horas)
Observação: a.Use luvas e máscaras de látex ao manusear o DEPC!b, ou sem esterilização DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (muitos laboratórios esterilização de alta temperatura duas vezes)
Considerações sobre extração de RNA
Dois fenômenos principais de falha no isolamento do RNA tecidual
Degradação do RNA e resíduos de impurezas nos tecidos,em relação à degradação, vamos primeiro ver por que o RNA extraído de células cultivadas não é facilmente degradado.Todos os reagentes de extração de RNA existentes contêm componentes que inibem rapidamente a RNase.Adicione o lisado às células cultivadas e simplesmente misture, todas as células podem ser bem misturadas com o lisado e as células são completamente lisadas.Depois que as células são lisadas, os ingredientes ativos no lisado inibem imediatamente a RNase intracelular, de modo que o RNA permanece intacto.Ou seja, porque as células cultivadas são fácil e totalmente contatadas com o lisado, seu RNA não é facilmente degradado;por outro lado, o RNA no tecido é facilmente degradado porque as células no tecido não são fáceis de entrar em contato rapidamente com o lisado.devido ao contato suficiente.Então,assumindo que existe uma maneira de transformar o tecido em uma única célula enquanto inibe a atividade do RNA, o problema da degradação pode ser completamente resolvido.
A moagem com nitrogênio líquido é o método mais eficaz.No entanto, o método de moagem com nitrogênio líquido é muito problemático, especialmente quando o número de amostras é grande.Isso deu origem à próxima melhor coisa: o homogeneizador.OhomogeneizadorO método não considera a questão de como a atividade da RNase é inibida antes que as células entrem em contato com o lisado, mas, em vez disso, reza para que a taxa de ruptura do tecido seja mais rápida do que a taxa na qual a RNase intracelular degrada o RN.
O efeito do homogeneizador elétrico é melhor,e o efeito do homogeneizador de vidro é ruim, mas, em geral, o método do homogeneizador não pode impedir o fenômeno de degradação.Portanto, se a extração for degradada, deve-se utilizar o homogeneizador elétrico original para moagem com nitrogênio líquido;o homogeneizador de vidro original deve ser alterado para um homogeneizador elétrico ou moído diretamente com nitrogênio líquido.O problema é quase 100% viável.se resolva.
O problema dos resíduos de impurezas que afetam os experimentos subsequentes tem causas mais diversas do que a degradação, e as soluções são correspondentemente diferentes.Para concluir,se houver degradação ou impurezas residuais no tecido, o método de extração/reagente para o material experimental específico deve ser otimizado.Você não precisa usar suas preciosas amostras para otimização: você pode comprar alguns pequenos animais como peixe/frango do mercado, pegar a parte correspondente do material para extração de RNA e a outra parte para extração de proteína – triturar com boca, estômago e extrato de intestinos.
O RNA alvo do RNA extraído é usado para diferentes experimentos de acompanhamento, e seus requisitos de qualidade são diferentes
A construção da biblioteca de cDNA requer integridade do RNA sem resíduos de inibidores de reação enzimática;Northern requer maior integridade de RNA e requisitos mais baixos para resíduos de inibidores de reação enzimática;RT-PCR não requer integridade de RNA muito alta,mas inibe as reações enzimáticas.Os requisitos de resíduos são rigorosos.A entrada determina a saída;toda vez que o objetivo é obter o RNA de maior pureza, isso custará às pessoas e ao dinheiro.
Coleta/Armazenamento de Amostras
Fatores que afetam a degradação Após a amostra deixar o corpo vivo/ou o ambiente de crescimento original, as enzimas endógenas da amostra começarão a degradar o RNA,e a taxa de degradação está relacionada ao conteúdo de enzimas endógenas e temperatura.Tradicionalmente, existem apenas duas maneiras de inibir completamente a atividade enzimática endógena: adicionar o lisado imediatamente e homogeneizar completa e rapidamente;corte em pedaços pequenos e congele imediatamente em nitrogênio líquido.Ambas as abordagens requerem operação rápida.Este último é adequado para todas as amostras, enquanto o primeiro é adequado apenas para tecidos com baixo teor de células e enzimas endógenas e mais fáceis de homogeneizar.Especificamente, tecido vegetal, fígado, timo, pâncreas, baço, cérebro, gordura, tecido muscular, etc. são melhor congelados com nitrogênio líquido antes de prosseguir.
Fragmentação e homogeneização de amostras
Fatores que afetam a degradação e o rendimento A fragmentação da amostra épara uma homogeneização completa, que é para liberação completa e completa de RNA.As células podem ser diretamente homogeneizadas sem serem quebradas.Os tecidos só podem ser homogeneizados depois de quebrados.Leveduras e bactérias precisam ser quebradas com as enzimas correspondentes antes que possam ser homogeneizadas.Tecidos com menor teor de enzima endógena e homogeneização mais fácil podem ser triturados e homogeneizados de uma só vez no lisado por um homogeneizador;tecido vegetal, fígado, timo, pâncreas, baço, cérebro, gordura, tecido muscular e outras amostras, Eles são ricos em enzimas endógenas ou não são facilmente homogeneizados,portanto, a ruptura e a homogeneização do tecido devem ser realizadas separadamente.O método de fragmentação mais confiável e produtivo é a moagem com nitrogênio líquido, e o método de homogeneização mais confiável é o uso de um homogeneizador elétrico.Uma observação especial sobre a moagem com nitrogênio líquido: a amostra não deve ser descongelada durante todo o processo de moagem, pois as enzimas endógenas têm maior probabilidade de funcionar quando congeladas.
Escolha do lisado
Afetando a conveniência da operação e os fatores de impurezas endógenas residuais As soluções de lise comumente usadas podem quase inibir a atividade da RNase.Portanto, o ponto chave de escolher uma solução de lise é considerar em combinação com o método de purificação.Há uma exceção:amostras com alto teor de enzimas endógenas são recomendadas para usar um lisado contendo fenol para aumentar a capacidade de inativar enzimas endógenas.
Escolha do método de purificação
Fatores que afetam impurezas endógenas residuais, velocidade de extração Para amostras limpas, como células, resultados satisfatórios podem ser obtidos com quase todos os métodos de purificação disponíveis.Mas para muitas outras amostras, especialmente aquelas com altos níveis de impurezas, como plantas, fígado, bactérias, etc., a escolha de um método de purificação adequado é crucial.O método de purificação centrífuga da coluna tem uma velocidade de extração rápida e pode efetivamente remover as impurezas que afetam a reação enzimática subsequente do RNA, mas é caro (Foregene pode oferecer kits econômicos, mais detalhes cliqueaqui);usando métodos de purificação econômicos e clássicos, como precipitação de LiCl, também podem obter resultados satisfatórios, mas o tempo de operação é longo..
“Três Disciplinas e Oito Atenções” para Extração de RNA
Disciplina 1:Acabe com a contaminação de enzimas exógenas.
Nota 1:Use estritamente máscaras e luvas.
Nota 2:Os tubos de centrífuga, pontas de prova, hastes de pipeta, tanques de eletroforese e bancadas experimentais envolvidas no experimento devem ser completamente descartados.
Nota 3:Os reagentes/soluções envolvidos no experimento, principalmente a água, devem ser livres de RNase.
Disciplina 2:Bloquear a atividade de enzimas endógenas
Nota 4:Escolha um método de homogeneização apropriado.
Nota 5:Escolha um lisado apropriado.
Nota 6:Controle a quantidade inicial da amostra.
Disciplina 3:Esclareça seu propósito de extração
Nota 7:Com qualquer sistema de lisado se aproximando da quantidade inicial máxima de amostra, a taxa de sucesso da extração cai drasticamente.
Nota 8:O único critério econômico para a extração de RNA bem-sucedida é o sucesso em experimentos subsequentes, não o rendimento.
As 10 principais fontes de contaminação por RNase
1. Os dedos são a primeira fonte de enzimas exógenas, por isso as luvas devem ser usadas e substituídas com frequência.Além disso, as máscaras também devem ser usadas, pois a respiração também é uma importante fonte de enzimas.Um benefício adicional de usar uma máscara de luva é proteger o experimentador.
2. Pontas de pipeta, tubos de centrífuga, pipetas – A RNase não pode ser inativada apenas por esterilização, portanto as pontas de pipeta e os tubos de centrífuga devem ser tratados com DEPC, mesmo que estejam marcados como tratados com DEPC.É melhor usar uma pipeta especial, limpe-a com uma bola de algodão com álcool 75% antes de usar, principalmente a haste;além disso, certifique-se de não usar um removedor de cabeça.
3. A água/tampão deve estar livre de contaminação por RNase.
4. Pelo menos a mesa de teste deve ser limpa com bolas de algodão com álcool 75%.
5. RNase endógena Todos os tecidos contêm enzimas endógenas, portanto, o congelamento rápido dos tecidos com nitrogênio líquido é a melhor maneira de reduzir a degradação.O método de armazenamento/moagem de nitrogênio líquido é realmente inconveniente, mas é o único caminho para tecidos com altos níveis de enzimas endógenas.
6. Amostras de RNA Os produtos de extração de RNA podem conter vestígios de contaminação por RNase.
7. Extração de plasmídeo A extração de plasmídeo geralmente usa Rnase para degradar o RNA, e a Rnase residual deve ser digerida com Proteinase K e extraída por PCI.
8. Armazenamento do RNA Mesmo que seja armazenado em baixa temperatura, vestígios de RNase causarão a degradação do RNA.A melhor solução para a preservação de longo prazo do RNA é uma suspensão de sal/álcool, porque o álcool inibe toda a atividade enzimática em baixas temperaturas.
9. Quando os cátions (Ca, Mg) contêm esses íons, o aquecimento a 80C por 5 minutos fará com que o RNA seja clivado, portanto, se o RNA precisar ser aquecido, a solução de preservação precisa conter um agente quelante (citrato de sódio 1 mM, pH 6,4).
10. Enzimas usadas em experimentos subseqüentes podem estar contaminadas por RNase.
10 dicas para extração de RNA
1: Impeça rapidamente a atividade de RNase.As amostras são congeladas rapidamente após a coleta, e a RNase é inativada pela operação rápida durante a lise.
2: Escolha um método de extração apropriado para tecido com alto teor de ribozima, e o tecido adiposo é melhor usar o método contendo fenol.
3: A qualidade da previsão requer Northern, a construção da biblioteca de cDNA requer alta integridade e RT-PCR e RPA (ensaio de proteção de ribonuclease) não requerem alta integridade.RT-PCR requer alta pureza (resíduos de inibidores de enzimas).
4: A homogeneização completa é a chave para melhorar o rendimento e reduzir a degradação.
5: Verifique a integridade da detecção de eletroforese de RNA, 28S: 18S = 2: 1 é um sinal completo, 1: 1 também é aceitável para a maioria dos experimentos.
6: Remoção de DNA para RT-PCR, análise de matriz É melhor usar Dnase I para remover DNA.
7: Reduzir a contaminação de enzimas exógenas – as enzimas não podem ser importadas de fora.
8: Ao concentrar ácido nucléico de baixa concentração, um reagente de co-precipitação deve ser adicionado.Mas para evitar que o co-precipitante contenha enzimas e contaminação de DNA.
9: Dissolva completamente o RNA, se necessário, aqueça a 65C por 5 minutos.
método de armazenamento adequado
Pode ser armazenado a –20C por um curto período de tempo e a –80C por um longo período.O primeiro passo para melhorar os rendimentos de RNA é perceber que o conteúdo de RNA de diferentes amostras varia muito.Alta abundância (2-4ug/mg) como fígado, pâncreas, coração, abundância média (0,05-2ug/mg) como cérebro, embrião, rim, pulmão, timo, ovário, baixa abundância (<0,05ug/mg) mg) como bexiga, osso, gordura.
1: Lise as células para liberar RN – se o RNA não for liberado, o rendimento será reduzido.A homogeneização elétrica funciona melhor do que outros métodos de homogeneização, mas também pode precisar ser combinada com outros métodos, como mistura de nitrogênio líquido, digestão enzimática (Lisozima/Liticase)
2: Otimização do método de extração.Os maiores problemas com métodos baseados em fenol são estratificação incompleta e perda parcial de RNA (o sobrenadante não pode ser completamente removido).A estratificação incompleta é devida ao alto teor de ácido nucleico e proteína, que pode ser resolvido aumentando a quantidade de lisado usado ou reduzindo a quantidade de amostra.Uma etapa de extração de clorofórmio foi adicionada ao tecido adiposo.A perda de RNA pode ser reduzida por bombeamento reverso ou pela remoção da camada orgânica seguida de centrifugação.O maior problema com métodos baseados em centrifugação de coluna é o excesso de amostra.
Dicas de extração clássicas
1. Purificação do fenol: Adicione um volume igual de 1:1 Fenol/Clorofórmio e misture vigorosamente por 1-2 minutos.Centrifugue em alta velocidade por 2 minutos.Remova cuidadosamente o sobrenadante (80-90%).Nunca chegue à camada do meio.Um volume igual da solução de reação pode ser adicionado a Fenol/Clorofórmio e o sobrenadante removido.Os dois sobrenadantes podem ser misturados para precipitação de ácido nucleico para melhorar o rendimento.Não seja muito delicado ao misturar e não tente remover todo o sobrenadante.
2. Lavagem com etanol 70-80%: Durante a lavagem, o ácido nucléico deve ser suspenso para garantir que o sal residual seja eliminado.Ao mesmo tempo, imediatamente após despejar o etanol, centrifugar em alta velocidade por alguns segundos e, a seguir, remover o etanol residual com uma pipeta.Dissolva após ficar em temperatura ambiente por 5-10 minutos.
11. Extração de organizações especiais
1. Tecido fibroso: A chave para a extração de RNA de tecido fibroso, como coração/músculo esquelético, é interromper completamente o tecido.Esses tecidos têm baixa densidade celular, portanto, a quantidade de RNA por unidade de peso do tecido é baixa e é melhor usar o máximo possível.Certifique-se de moer o tecido completamente sob condições de congelamento.
2. Tecidos com alto teor de proteína/gordura: o teor de gordura vegetal/cérebro é alto.Após a extração PCI, o sobrenadante contém flóculos brancos.O sobrenadante deve ser reextraído com clorofórmio.
3. Tecidos com alto teor de ácido nucleico/ribozima: o baço/timo tem alto teor de ácido nucleico e ribozima.A moagem do tecido sob condições de congelamento seguida de rápida homogeneização pode efetivamente inativar as ribozimas.No entanto, se o lisado for muito viscoso (devido ao alto teor de ácido nucleico), a extração de PCI não será capaz de estratificar efetivamente;adicionar mais lisado pode resolver esse problema.Extrações múltiplas de PCI podem remover mais DNA residual.Se um precipitado branco se formar imediatamente após a adição de álcool, isso indica contaminação por DNA.A reextração com PCI ácido após a dissolução pode remover a contaminação do DNA.
4. Tecido vegetal: O tecido vegetal é mais complexo que o tecido animal.Geralmente, as plantas são moídas sob condições de nitrogênio líquido, de modo que a degradação do RNA por enzimas endógenas é incomum.Se o problema de degradação não for resolvido, é quase certo que seja causado por impurezas contidas na amostra.As impurezas contidas em muitas plantas levarão a resíduos, e a razão para os resíduos é muitas vezes porque essas impurezas têm algumas semelhanças com o RNA: você precipita e eu precipito, e você adsorve e eu adsorvo.Estas características determinam que sejam inibidores enzimáticos muito fortes.
Atualmente, os reagentes comerciais de extração de RNA podem ser adaptados a quase todos os tecidos animais com pequenos ajustes, mas existem poucos reagentes comerciais de extração de RNA que podem ser adequados para a maioria dos tecidos vegetais.Felizmente, a Foregene pode fornecerkits de extração de RNA vegetal, Nós temosKit de isolamento de RNA total da planta, Kit de isolamento de RNA total da planta Plus.Este último é especialmente projetado para plantas com alto teor de polissacarídeos e polifenóis.Para extração de RNA, o feedback dos usuários de laboratório é particularmente bom.
12. O efeito do congelamento e descongelamento da amostra A amostra congelada pode ser maior e precisa ser cortada antes de ser usada para extração de RNA.As amostras tendem a derreter (possivelmente parcialmente) durante o corte.Amostras congeladas podem precisar ser pesadas antes da extração de RNA, e o descongelamento definitivamente ocorrerá durante este processo.Às vezes, o descongelamento da amostra também ocorre durante o processo de moagem de nitrogênio líquido;ou a amostra congelada é adicionada diretamente ao lisado sem moagem de nitrogênio líquido, e o descongelamento definitivamente ocorrerá antes da completa homogeneização.Experimentos mostraram que o tecido congelado é mais propenso à degradação do RNA durante o descongelamento do que o tecido fresco.O motivo provável: o processo de congelamento e descongelamento interrompe as estruturas dentro da célula, tornando mais fácil para as enzimas endógenas entrarem em contato direto com o RNA.
13. Julgamento da qualidade do RNA Normalmente, a eletroforese é usada para julgar a integridade do RNA, e o A260/A280 é usado para julgar a pureza do RNA.Em teoria, o RNA intacto tem uma proporção de 28S:18S = 2,7:1, e a maioria dos dados enfatiza a proporção de 28S:18S = 2:1.O fato é que quase nenhum RNA extraído de amostras que não sejam células está na proporção de 2:1 (isso foi obtido com o Agilent Bioanalyzer).
Os resultados da eletroforese de RNA são afetados por muitos fatores, incluindo estrutura secundária, condições de eletroforese, carga de amostra, grau de saturação por EB, etc. Use eletroforese nativa para detectar RNA e use DNA Marker como controle.Se o 28S em 2kb e o 18S em 0,9kb estiverem limpos e 28S: 18S > 1, a integridade pode atender aos requisitos da maioria dos experimentos subsequentes.
A260/A280 é um indicador que tem causado muita confusão.Em primeiro lugar, é necessário esclarecer o significado original deste indicador para os ácidos nucléicos: RNA puro, seu A260/280 = cerca de 2,0.ARN puro é a 'causa' e A260/A280 = 2 é o 'efeito'.Agora todos estão usando A260/A280 como uma 'causa', pensando que “se A260/A280 = 2, então o RNA é puro”, o que naturalmente leva à confusão.
Se estiver interessado, você pode adicionar um pouco de reagente que é frequentemente usado na extração, como fenol, isotiocianato de guanidina, PEG, etc., à sua amostra de RNA e, em seguida, medir a proporção A260/A280.A realidade é que muitos dos reagentes usados para extração de RNA, assim como muitas impurezas na amostra, absorvem cerca de A260 e A280, afetando A260/A280.
A abordagem mais instrutiva no momento é escanear amostras de RNA na faixa de 200-300 nm.A curva do RNA puro tem as seguintes características: a curva é suave, A230 e A260 são dois pontos de inflexão, A300 está próximo de 0, A260/A280 = em torno de 2,0 e A260/A230 = em torno de 2,0.Se os dados da varredura não estiverem disponíveis, a proporção A260/A230 também deve ser determinada, pois essa proporção é mais sensível ao transporte de todas as impurezas que afetam a reação enzimática.Leve em consideração o alcance linear do dispositivo (0,1–0,5 para A260).
Existem dois outros fenômenos úteis: a proporção será cerca de 0,3 menor quando o A260/A280 for medido na água;enquanto a proporção medida em 10 mM EDTA é cerca de 0,2 maior do que a medida em 1 mM EDTA.
Produtos relacionados:
Série de isolamento de RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Horário da postagem: 15 de julho de 2022
