O RT-qPCR é o experimento básico da biologia molecular e todos devem estar familiarizados com ele.Inclui principalmente três etapas: extração de RNA, transcrição reversa em cDNA e PCR quantitativo fluorescente em tempo real.Não ajuda, o que está acontecendo?É provável que haja algum problema como experimento de transcrição reversa!Embora pareça que o experimento de transcrição reversa só precisa adicionar RNA, dNTP, primers etranscriptase reversaao tubo da centrífuga e misture bem, mas no processo de operação real, ainda há muitos detalhes que precisam ser observados.Vamos aprender sobre isso!

Como julgar a qualidade do RNA?
Para obter cDNA, a qualidade do RNA é crítica!A qualidade do RNA pode ser detectada principalmente a partir de dois aspectos:
(1) Integridade do RNA:A integridade do RNA pode ser verificada por eletroforese em gel de agarose. Tomando como exemplo os eucariotos, o RNA total completo tem três bandas claras, os pesos moleculares de grande a pequeno são 28S, 18S e 5S, e 28S é duas vezes mais brilhante que 18S;se três bandas puderem ser vistas, mas o tipo de banda estiver borrado ou Difusão significa que o RNA está parcialmente degradado.Neste momento, execute a reação de transcrição reversa imediatamente e aumente a entrada do modelo adequadamente;se apenas uma banda com um pequeno peso molecular ou nenhuma banda puder ser vista, o RNA foi completamente degradado e precisa ser reextraído.Agilent 2100 indica a integridade do RNA com diagrama de pico e valor RIN.Se o ácido nucleico estiver intacto, a linha de base do eletroferograma é plana;se o ácido nucléico estiver severamente degradado, a linha de base é irregular e aparecem mais picos de degradação;o valor de RIN reflete a integridade do RNA, dentro da faixa de 0-10, quanto maior o valor, melhor a qualidade do RNA.Bem, quanto maior o grau de completude.
(2) Pureza do RNA:A proporção de OD260/280 pode ser detectada por espectrofotometria UV.Se a proporção de OD260/280 estiver entre 1,9 e 2,1, a pureza é muito boa.
DNA genômico residual pode levar a resultados quantitativos imprecisos
Quando o RNA é extraído, o RNA que obtemos pode ser misturado com o DNA genômico (gDNA) que não foi limpo.Portanto, o cDNA após a transcrição reversa também será misturado comgDNA.durante a jusanteqPCRreação,cDNAe o gDNA pode ser amplificado simultaneamente, resultando em um valor de CT relativamente pequeno, portanto, os resultados podem ser tendenciosos.
Então, o que devemos fazer nesta situação?Foregenesugere:
(1) Realize a limpeza do genoma no RNA reverso, que pode ser removido por extração em coluna durante a extração do RNA;
(2) Trate o RNA extraído com DNaseI , mas finalize-o com EDTA;
de reagentes de transcrição reversacom módulos de limpeza do genoma;

Como escolher primers para transcrição reversa?
Os primers de transcrição reversa também afetam o resultado da reação de transcrição reversa.Você pode escolher primers aleatórios, Oligo dT ou primers específicos de gene para transcrição reversa de acordo com as circunstâncias específicas do experimento:
(1) Transcrições específicas: primers específicos para genes são recomendados;
(2) Transcrições de fragmentos longos: Recomendam-se primers oligo dT/gene-específicos;
(3) Fragmentos internos de transcrições de segmento longo: primers específicos do gene/primers aleatórios/primers aleatórios + Oligo dT.Se o experimento qPCR subsequente for realizado, o Oligo dT não pode ser usado sozinho, porque o uso do Oligo dT sozinho pode causar viés de extremidade 3', levando a resultados imprecisos do experimento qPCR;
(4) miRNA: Podem ser usados ​​primers de haste-loop ou tailing primers.

Quantas vezes o cDNA do produto da transcrição reversa deve ser diluído para quantificação?
Depois de obter o cDNA do produto da transcrição reversa, quantas vezes o cDNA deve ser diluído para experimentos de qPCR é muito importante.Se a concentração de cDNA for muito alta ou muito baixa, a eficiência da amplificação pode ser afetada.A concentração de cDNA pode ser medida e como isso deve ser feito?
(1) A concentração de cDNA do produto de transcrição reversa não pode ser medida porque, além do produto de cDNA, o produto de transcrição reversa também contém tampão residual de transcrição reversa, transcriptase reversa, primers, etc.Neste momento, dirão alguns amigos, então medirei a concentração após a purificação;aqui, Foregene gostaria de lembrar que o cDNA não é recomendado para ser purificado, porque o comprimento do cDNA obtido pela reversão é diferente, e o cDNA curto será perdido na purificação.
(2) Então, o que fazer?Antes do experimento qPCR, o gradiente de diluição do cDNA pode ser determinado através do pré-experimento.Por exemplo: use solução estoque de cDNA, diluição de 10 vezes e diluição de 100 vezes como modelos para experimentos de qPCR e selecione o fator de diluição com um valor CT na faixa de 18-28.

Como os miRNAs devem ser transcritos reversamente?
O miRNA é uma pequena molécula de RNA de fita simples com um tamanho de cerca de 22 nt que não codifica proteínas.Devido ao seu comprimento curto, o método qPCR convencional é difícil de quantificar diretamente, por isso muitas vezes é necessário estender o miRNA;os métodos de transcrição reversa comumente usados ​​para miRNA incluem método de haste-laço e método de cauda.
O método de haste-loop é estender o miRNA adicionando primers de haste-laço.Este método de detecção tem maior sensibilidade e especificidade, mas a taxa de transferência de detecção é baixa.Uma transcrição reversa pode detectar apenas um miRNA e uma referência interna;o método tail-adding é composto por duas enzimas. É completado pela ação conjunta de duas enzimas, que são a polimerase poliA e a transcriptase reversa.A polimerase PolyA é responsável por adicionar caudas PolyA ao miRNA para aumentar seu comprimento, e a transcriptase reversa realiza a reação de transcrição reversa.Este método tem alto rendimento de detecção e pode detectar vários miRNAs e referências internas em uma transcrição reversa, mas a sensibilidade e a especificidade são baixas no método de haste-loop.