Base de design do primer (99% dos problemas podem ser resolvidos)
1. Comprimento do primer: O livro didático requer 15-30bp, geralmente cerca de 20bp.A condição real é melhor ser 18-24bp para garantir a especificidade, mas quanto mais tempo, melhor, primer muito longo também reduzirá a especificidade e reduzirá o rendimento.
2. Extensão de amplificação do primer: 200-500bp é apropriado, e o fragmento pode ser expandido para 10kb sob condições específicas.
3. Base do primer: O conteúdo de G+C deve ser de 40-60%, muito pouco efeito de amplificação G+C não é bom, muito G+C é fácil de aparecer bandas não específicas.ATGC é melhor distribuído aleatoriamente, evitando aglomerados de mais de 5 nucleotídeos de purina ou pirimidina.Multi-gc para a extremidade 5' e sequências intermediárias para aumentar a estabilidade, evitar GC rico na extremidade 3', sem GC para as últimas 3 bases ou sem GC para 3 das últimas 5 bases.
4. Evitar a estrutura secundária nos primers, e evitar a complementação entre dois primers, principalmente a complementação na extremidade 3', caso contrário, será formado o dímero do primer e serão geradas bandas amplificadas inespecíficas.
5. As bases na extremidade 3' dos primers, especialmente as últimas e penúltimas bases, devem ser rigorosamente pareadas para evitar falhas de PCR devido a bases terminais não pareadas.
6. Os primers têm ou podem ser adicionados com locais de clivagem apropriados, e a sequência alvo amplificada deve preferencialmente ter locais de clivagem apropriados, o que é muito benéfico para análise de clivagem ou clonagem molecular.
7. Especificidade dos primers: os primers não devem ter homologia óbvia com outras sequências no banco de dados de sequências de ácidos nucleicos.
8. Aprenda a usar o software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (este design online funciona melhor).
O conteúdo acima pode resolver pelo menos 99% dos problemas de design de primer.
Controle os detalhes do design do primer
1. Comprimento do primer
O comprimento geral do primer é de 18 a 30 bases.Em geral, o fator mais importante que determina a temperatura de recozimento do primer é o comprimento do primer.A temperatura de recozimento do primer é geralmente selecionada (valor Tm -5℃), e alguns usam diretamente o valor Tm.As fórmulas a seguir podem ser usadas para calcular aproximadamente a temperatura de recozimento dos primers.
Quando o comprimento do primer for menor que 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Quando o comprimento do primer é maior que 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/comprimento-5℃
Além disso, muitos softwares também podem ser usados para calcular a temperatura de recozimento, o princípio de cálculo será diferente, portanto, às vezes, o valor calculado pode ter uma pequena lacuna.Para otimizar as reações de PCR, os primers mais curtos que garantem temperaturas de recozimento não inferiores a 54 ℃ são usados para a melhor eficiência e especificidade.
No geral, a especificidade do primer aumenta em um fator de quatro para cada nucleotídeo adicional, de modo que o comprimento mínimo do primer para a maioria das aplicações é de 18 nucleotídeos.O limite superior do comprimento do primer não é muito importante, principalmente relacionado à eficiência da reação.Por causa da entropia, quanto mais longo o iniciador, menor a taxa na qual ele se liga ao DNA alvo para formar um modelo estável de fita dupla para a DNA polimerase se ligar.
Ao usar software para projetar primers, o comprimento dos primers pode ser determinado pelo valor TM por sua vez, especialmente para primers de PCR quantitativo de fluorescência, TM = 60 ℃ ou mais deve ser controlado.
2.Conteúdo do GC
Geralmente, o conteúdo de G+C nas sequências de primers é de 40% a 60%, e o conteúdo de GC e o valor de Tm de um par de primers devem ser coordenados.Se o primer tiver uma tendência grave de GC ou AT, a quantidade apropriada de cauda A, T ou G e C pode ser adicionada à extremidade 5' do primer.
3. Temperatura de recozimento
A temperatura de recozimento deve ser 5 ℃ inferior à temperatura de desencadeamento.Se o número de bases do primer for pequeno, a temperatura de recozimento pode ser aumentada adequadamente, o que pode aumentar a especificidade da PCR.Se o número de bases for grande, a temperatura de recozimento pode ser reduzida apropriadamente.A diferença de temperatura de recozimento entre um par de primers de 4℃ ~ 6℃ não afetará o rendimento da PCR, mas idealmente a temperatura de recozimento de um par de primers é a mesma, que pode variar entre 55℃ ~ 75℃.
4. Evite a área da estrutura secundária do modelo de amplificação
É melhor evitar a região da estrutura secundária do modelo ao selecionar o fragmento amplificado.A estrutura secundária estável do fragmento de destino pode ser prevista e estimada pelo software de computador relevante, o que é útil para a seleção do modelo.Resultados experimentais mostram que a expansão geralmente não é bem-sucedida quando a energia livre (△G) da região a ser expandida é menor que 58,6lkJ/mol.
5. Incompatibilidade com o DNA alvo
Quando a sequência de DNA alvo amplificada é grande, um iniciador pode se ligar a várias partes do DNA alvo, resultando em várias bandas aparecendo no resultado.Desta vez é necessário utilizar o teste de software BLAST, site:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Selecione Alinhar duas sequências (bl2seq).
Colar sequências de primer na zona 1 e sequências de DNA alvo na zona 2 é intercambiável, e o BLAST calcula complementar, antisense e outras possibilidades, para que os usuários não precisem perceber se ambas as cadeias são cadeias de sentido.Você também pode inserir o número GI se souber o número GI da sequência no banco de dados, para não precisar colar uma grande seção da sequência.Por fim, clique em Alinhar em 3 para ver se o iniciador tem vários locais homólogos no DNA alvo.
6. Terminal primário
A ponta 3' do primer é onde começa a extensão, por isso é importante evitar que desemparelhamentos comecem por aí.A extremidade 3' não deve ser superior a 3 G ou C consecutivos, pois isso fará com que o iniciador seja acionado erroneamente na região de sequência de enriquecimento G+C.A extremidade 3' não pode formar nenhuma estrutura secundária, exceto em reações especiais de PCR (AS-PCR), a extremidade 3' do primer não pode ser incompatível.Por exemplo, se a região de codificação for amplificada, a extremidade 3' do primer não deve terminar na terceira posição do códon, porque a terceira posição do códon é propensa a degenerar, o que afetará a especificidade e a eficiência da amplificação.Ao usar primers de anexação, consulte a tabela de uso de códons, preste atenção à preferência biológica, não use primers de anexação na extremidade 3' e use uma concentração maior de primers (1uM-3uM).
7. Estrutura secundária de primers
Os próprios primers não devem ter sequências complementares, caso contrário, os próprios primers se dobrarão em estruturas em grampo, e essa estrutura secundária afetará a ligação de primers e modelos devido ao impedimento estérico.Se o julgamento artificial for usado, as bases complementares contínuas dos próprios primers não devem ser maiores que 3bp.Não deve haver complementaridade entre os dois primers, especialmente a sobreposição complementar da extremidade 3' deve ser evitada para evitar a formação de dímeros de primer.Em geral, não deve haver mais de 4 bases consecutivas de homologia ou complementaridade entre um par de primers.
8. Adicione marcadores ou loci
A extremidade 5' tem pouco efeito na especificidade da amplificação e pode, portanto, ser modificada sem afetar a especificidade da amplificação.A modificação da extremidade 5' do iniciador incluiu: adição de sítio de restrição enzimática;Biotina marcada, fluorescência, digoxina, Eu3+, etc. Introduzir sequências de DNA de ligação a proteínas;Introdução de locais de mutação, inserção e ausência de sequências de mutação e introdução de sequências promotoras, etc. As bases extras afetarão mais ou menos a eficiência da amplificação e aumentarão a chance de formação de dímeros de primer, mas algumas concessões devem ser feitas para a próxima etapa.Sequências adicionais que não existem na sequência alvo, como sítios de restrição e sequências promotoras, podem ser adicionadas à extremidade 5' do iniciador sem afetar a especificidade.Essas sequências não são incluídas no cálculo dos valores de Tm do primer, mas devem ser testadas quanto à complementaridade e estrutura secundária interna.
9. Subclones
Na maioria das vezes, a PCR é apenas uma clonagem preliminar e, em seguida, precisamos subclonar o fragmento alvo em vários vetores, portanto, precisamos projetar bases adicionais para a próxima operação na etapa de PCR.
Algumas sequências projetadas para subclonagem são resumidas abaixo.
O local de restrição da endonuclease de restrição foi adicionado
A adição de sítios de restrição enzimática é o método mais comumente usado para subclonar produtos de PCR.Geralmente, o local de clivagem é de seis bases, além da extremidade 5 'do local de clivagem, é necessário adicionar 2 ~ 3 bases protetoras.No entanto, o número de bases protetoras exigidas por diferentes enzimas é diferente.Por exemplo, SalⅠ não requer base protetora, EcoRⅤ requer 1 base protetora, NotⅠ requer 2 bases protetoras e Hind Ⅲ requer 3 bases protetoras.
LIC adiciona a cauda
O nome completo de LIC é Clonagem Independente de Ligação, um método de clonagem inventado pela Navogen especificamente para sua parte do vetor pET.O transportador pET preparado pelo método LIC tem extremidades pegajosas de fita única de base 12-15 não complementares, que complementam as extremidades pegajosas correspondentes no fragmento de inserção alvo.Para fins de amplificação, a sequência 5' do iniciador do fragmento inserido deve complementar o vetor LIC.A atividade de extração 3'→5' da T4 DNA polimerase pode formar uma extremidade pegajosa de fita única no fragmento inserido após um curto período de tempo.Como o produto só pode ser formado a partir do recozimento mútuo do fragmento de inserção preparado e do vetor, esse método é muito rápido e eficiente e é uma clonagem direcionada.
Clone de TA direcionado adiciona cauda
A clonagem TA foi incapaz de direcionar o fragmento para um vetor, então mais tarde a Invitrogen introduziu um vetor que poderia direcionar a clonagem, que continha quatro GTGGS de base proeminente em uma extremidade.Portanto, no desenho de primers de PCR, as sequências complementares devem ser adicionadas de acordo, para que os fragmentos possam ser “orientados”.
Se você estiver com pouco tempo, pode tentar a síntese direta, combinando o gene com o vetor, que é o que chamamos de síntese do gene ET nos musecularistas.
D. Método de clonagem In-Fusion
Nenhuma ligase é necessária, nenhuma reação longa é necessária.Desde que uma sequência em ambas as extremidades do vetor linearizado seja introduzida no projeto de primers, o produto de PCR e o vetor linearizado são adicionados à solução de enzima em fusão contendo BSA e colocados à temperatura ambiente por meia hora, a transformação pode ser realizada.Este método é particularmente adequado para conversão de grandes volumes.
10. Mesclar primer
Às vezes, apenas informações de sequência limitadas são conhecidas sobre o design do primer.Por exemplo, se apenas a sequência de aminoácidos for conhecida, o iniciador de fusão pode ser projetado.Um iniciador de fusão é uma mistura de diferentes sequências que representam todas as diferentes possibilidades de base que codificam um único aminoácido.Para aumentar a especificidade, você pode consultar a tabela de uso de códons para reduzir a anexação de acordo com as preferências de uso de base de diferentes organismos.A hipoxantina pode ser combinada com todas as bases para reduzir a temperatura de recozimento do primer.Não use as bases anexadas na extremidade 3' do primer porque o recozimento das últimas 3 bases na extremidade 3' é suficiente para iniciar a PCR no local errado.Concentrações mais altas de primers (1μM a 3μM) são usadas porque os primers em muitas misturas de anexação não são específicos para o modelo de destino.
matérias-primas de PCRao controle
1. Quantidade de primer
A concentração de cada primer é de 0,1 ~ 1umol ou 10 ~ 100pmol.É melhor produzir o resultado necessário com a menor quantidade de primer.Alta concentração de primer causará incompatibilidade e amplificação não específica e aumentará a chance de formação de dímeros entre os primers.
2. Concentração de primer
A concentração de primers afeta a especificidade.A concentração ideal de primer é geralmente entre 0,1 e 0,5 μM.Concentrações mais altas de primer levam à amplificação de produtos inespecíficos.
3. Temperatura de recozimento do primer
Outro parâmetro importante para primers é a temperatura de fusão (Tm).Esta é a temperatura quando 50% dos primers e sequências complementares são representados como moléculas de DNA de fita dupla.Tm é necessário para definir a temperatura de recozimento do PCR.Idealmente, a temperatura de recozimento é baixa o suficiente para garantir o recozimento eficaz dos primers com a sequência alvo, mas alta o suficiente para reduzir a ligação inespecífica.Temperatura de recozimento razoável de 55℃ a 70℃.A temperatura de recozimento é geralmente ajustada 5℃ abaixo da Tm do primer.
Existem várias fórmulas para definir o Tm, que variam muito dependendo da fórmula utilizada e da sequência de primers.Como a maioria das fórmulas fornece um valor estimado de Tm, todas as temperaturas de recozimento são apenas um ponto de partida.A especificidade pode ser melhorada analisando várias reações que aumentam progressivamente a temperatura de recozimento.Comece abaixo do Tm-5℃ estimado e aumente gradualmente a temperatura de recozimento em um incremento de 2℃.Uma temperatura de recozimento mais alta reduzirá a formação de dímeros de primer e produtos não específicos.Para melhores resultados, os dois primers devem ter valores aproximados de Tm.Se a diferença de Tm dos pares de primers for superior a 5 ℃, os primers mostrarão um início falso significativo usando uma temperatura de recozimento mais baixa no ciclo.Se os dois primers Tm forem diferentes, defina a temperatura de recozimento para 5 ℃ abaixo do Tm mais baixo.Alternativamente, para aumentar a especificidade, cinco ciclos podem ser executados primeiro em temperaturas de recozimento projetadas para Tm mais altas, seguidas pelos ciclos restantes em temperaturas de recozimento projetadas para Tm mais baixas.Isso permite que uma cópia parcial do modelo de destino seja obtida em condições restritas.
4. Pureza e estabilidade do primer
A pureza padrão dos primers personalizados é adequada para a maioria das aplicações de PCR.A remoção de grupos benzoil e isobutilil por dessalinização é mínima e, portanto, não interfere com a PCR.Algumas aplicações requerem purificação para remover quaisquer sequências não completas no processo de síntese.Essas sequências truncadas ocorrem porque a eficiência da química de síntese de DNA não é 100%.Este é um processo circular que usa reações químicas repetidas à medida que cada base é adicionada para fazer o DNA de 3' para 5'.Você pode falhar em qualquer um dos ciclos.Primers mais longos, especialmente aqueles com mais de 50 bases, possuem uma grande proporção de sequências truncadas e podem requerer purificação.
O rendimento dos primers é afetado pela eficiência da química sintética e do método de purificação.Empresas biofarmacêuticas, como Cytology e Shengong, usam uma unidade OD mínima para garantir a produção total de oligonucleosídeo.Os primers personalizados são enviados na forma de pó seco.É melhor redissolver os primers em TE para que a concentração final seja de 100μM.A TE é melhor do que a água desionizada porque o pH da água é frequentemente ácido e causará a hidrólise dos oligonucleósidos.
A estabilidade dos primers depende das condições de armazenamento.Pó seco e primers dissolvidos devem ser armazenados a -20 ℃.Primers dissolvidos em TE em concentrações superiores a 10μM podem ser armazenados de forma estável a -20 ℃ por 6 meses, mas só podem ser armazenados em temperatura ambiente (15 ℃ a 30 ℃) por menos de 1 semana.Os primers em pó seco podem ser armazenados a -20 C por pelo menos 1 ano e em temperatura ambiente (15 C a 30 C) por até 2 meses.
5. Enzimas e suas concentrações
Atualmente, a Taq DNA polimerase utilizada é basicamente a enzima de engenharia genética sintetizada por bactérias coliformes.A quantidade de enzima necessária para catalisar uma reação de PCR típica é de cerca de 2,5U (refere-se ao volume total de reação de 100ul).Se a concentração for muito alta, pode levar à amplificação inespecífica;se a concentração for muito baixa, a quantidade de produto sintético será reduzida.
6. Qualidade e concentração de dNTP
A qualidade do dNTP está intimamente relacionada com a concentração e a eficiência da amplificação por PCR.O pó dNTP é granular e sua variabilidade perde sua atividade biológica se for armazenado de forma inadequada.A solução dNTP é ácida e deve ser usada em alta concentração, com solução tampão 1M NaOH ou 1M Tris.HCL para ajustar seu PH para 7,0 ~ 7,5, pequena quantidade de subembalagem, armazenamento congelado a -20℃.O congelamento-descongelamento múltiplo degradará o dNTP.Na reação de PCR, o dNTP deve ser de 50 ~ 200umol/L.Especialmente, atenção deve ser dada para que a concentração dos quatro DNTPS seja igual (preparação de mol igual).Se a concentração de qualquer um deles for diferente das demais (maior ou menor), ocorrerá uma incompatibilidade.Uma concentração muito baixa reduzirá o rendimento dos produtos de PCR.dNTP pode combinar com Mg2+ e reduzir a concentração de Mg2+ livre.
7. Ácido nucleico modelo (gene alvo)
A quantidade e o grau de purificação do ácido nucleico modelo é um dos elos principais para o sucesso ou falha da PCR.Os métodos tradicionais de purificação de DNA geralmente usam SDS e protease K para digerir e descartar as amostras.As principais funções do SDS são: dissolver lipídios e proteínas na membrana celular, destruindo assim a membrana celular dissolvendo as proteínas da membrana e dissociando proteínas nucleares na célula, o SDS também pode se combinar com proteínas e precipitar;A protease K pode hidrolisar e digerir proteínas, especialmente histonas ligadas ao DNA, e então usar o solvente orgânico fenol e clorofórmio para extrair proteínas e outros componentes celulares, e usar etanol ou álcool isopropílico para precipitar o ácido nucléico.O ácido nucleico extraído pode ser usado como modelo para reações de PCR.Para espécimes de detecção clínica geral, um método rápido e simples pode ser usado para dissolver células, lisar patógenos, digerir e remover proteínas de cromossomos para liberar genes-alvo e usar diretamente para amplificação por PCR.A extração do modelo de RNA geralmente usa o método de isotiocianato de guanidina ou protease K para evitar que a RNase degrade o RNA.
8. Concentração de Mg2+
Mg2+ tem um efeito significativo na especificidade e rendimento da amplificação por PCR.Na reação de PCR geral, quando a concentração de vários dNTP é 200umol/L, a concentração apropriada de Mg2+ é 1,5 ~ 2,0mmol/L.A concentração de Mg2+ é muito alta, a especificidade da reação diminui, ocorre amplificação não específica, concentração muito baixa reduzirá a atividade da Taq DNA polimerase, resultando na redução dos produtos da reação.
Os íons de magnésio afetam vários aspectos da PCR, como a atividade da DNA polimerase, que afeta o rendimento;Outro exemplo é o recozimento de primers, que afeta a especificidade.O dNTP e o molde se ligam ao íon magnésio, reduzindo a quantidade de íon magnésio livre necessária para a atividade enzimática.A concentração ideal de íons de magnésio varia para diferentes pares de primers e modelos, mas uma concentração inicial típica de PCR com 200μM dNTP é de 1,5mM (nota: para PCR quantitativo em tempo real, use solução de íons de magnésio de 3 a 5mM com uma sonda fluorescente).Concentrações mais altas de íons livres de magnésio aumentam o rendimento, mas também aumentam a amplificação não específica e diminuem a fidelidade.Para determinar a concentração ideal, as titulações de íons de magnésio foram realizadas em incrementos de 0,5mM de 1mM a 3mM.Para reduzir a dependência da otimização de íons de magnésio, a polimerase de DNA Platinum Taq pode ser usada.A Taq DNA polimerase de platina é capaz de manter a função em uma faixa mais ampla de concentrações de íons de magnésio do que a Taq DNA polimerase e, portanto, requer menos otimização.
9. Aditivos promotores de PCR
A otimização da temperatura de recozimento, design do primer e concentração de íons de magnésio é suficiente para amplificação altamente específica da maioria dos modelos;no entanto, alguns modelos, incluindo aqueles com alto conteúdo de GC, requerem medidas adicionais.Os aditivos que afetam a temperatura de fusão do DNA fornecem outra maneira de melhorar a especificidade e o rendimento do produto.A desnaturação completa do modelo é necessária para melhores resultados.
Além disso, a estrutura secundária impede a ligação do primer e a extensão da enzima.
Aditivos de PCR, incluindo formamida, DMSO, glicerina, betaína e PCRx Enhancer Solution, aumentam a amplificação.Seu possível mecanismo é reduzir a temperatura de fusão, auxiliando assim no recozimento dos primers e na extensão da DNA polimerase através da região da estrutura secundária.A Solução PCRx tem outras vantagens.Otimização mínima de íons de magnésio é necessária quando usado com polimerase de DNA Platinum Taq e polimerase de DNA Platinum Pfx.Assim, a técnica Platinum é combinada com o aditivo para aumentar a especificidade enquanto reduz a dependência da terceira abordagem, a otimização do íon magnésio.Para melhores resultados, a concentração de aditivos deve ser otimizada, especialmente DMSO, formamida e glicerol, que inibem a Taq DNA polimerase.
10. Partida a quente
A PCR de início a quente é um dos métodos mais importantes para melhorar a especificidade da PCR, além de um bom design de primer.Embora a temperatura de alongamento ideal da Taq DNA polimerase seja de 72 ℃, a polimerase permanece ativa à temperatura ambiente.Assim, produtos não específicos são produzidos quando a temperatura de manutenção é menor que a temperatura de anelamento durante a preparação da reação de PCR e no início do ciclo térmico.Uma vez formados, esses produtos inespecíficos são efetivamente amplificados.A PCR de início rápido é particularmente eficaz quando os locais usados para o design do primer são limitados pela localização de elementos genéticos, como mutações direcionadas ao local, clonagem de expressão ou construção e manipulação de elementos genéticos usados para engenharia de DNA.
Um método comum para limitar a atividade da Taq DNA polimerase é preparar a solução de reação de PCR em gelo e colocá-la em um aparelho de PCR pré-aquecido.Este método é simples e barato, mas não completa a atividade da enzima e, portanto, não elimina completamente a amplificação de produtos não específicos.
A iniciação térmica atrasa a síntese de DNA inibindo um componente essencial até que o aparelho de PCR atinja a temperatura de desnaturação.A maioria dos métodos manuais de iniciação térmica, incluindo adição retardada de Taq DNA polimerase, são complicados, especialmente para aplicações de alto rendimento.Outros métodos de primer térmico usam um escudo de cera para envolver um componente essencial, incluindo íons de magnésio ou enzimas, ou para isolar fisicamente componentes reativos, como modelos e tampões.Durante o ciclo térmico, os vários componentes são liberados e misturados à medida que a cera derrete.Assim como o método de partida a quente manual, o método de proteção de cera é complicado e propenso a contaminação e não é adequado para aplicações de alto rendimento.
A DNA polimerase de platina é conveniente e eficiente para PCR automático de início a quente.Platinum Taq DNA polimerase consiste em Taq DNA polimerase recombinante combinada com anticorpo monoclonal contra Taq DNA polimerase.Os anticorpos são formulados por PCR para inibir a atividade enzimática durante manutenção prolongada de temperatura.A Taq DNA polimerase foi liberada na reação durante o isolamento de 94 ℃ da etapa de desnaturação, restaurando a atividade total da polimerase.Em contraste com a Taq DNA polimerase quimicamente modificada para iniciação térmica, a enzima Platinum não requer isolamento prolongado a 94 ℃ (10 a 15 minutos) para ativar a polimerase.Com a polimerase de DNA PlatinumTaq, 90% da atividade da polimerase de DNA Taq foi restaurada após 2 minutos a 94 ℃.
11. Nest-PCR
Rodadas sucessivas de amplificação usando primers aninhados podem melhorar a especificidade e a sensibilidade.A primeira rodada é uma amplificação padrão de 15 a 20 ciclos.Uma pequena fração do produto de amplificação inicial foi diluída de 100 a 1.000 vezes e adicionada à segunda rodada de amplificação por 15 a 20 ciclos.Alternativamente, o produto amplificado inicial pode ser dimensionado por purificação em gel.Um iniciador aninhado é usado na segunda rodada de amplificação, que pode se ligar à sequência alvo dentro do primeiro iniciador.O uso de nested PCR reduz a possibilidade de amplificação de múltiplos sítios-alvo porque existem poucas sequências-alvo complementares a ambos os conjuntos de primers.O mesmo número total de ciclos (30 a 40) com os mesmos primers amplificou os sítios inespecíficos.A PCR aninhada aumenta a sensibilidade de sequências-alvo limitadas (por exemplo, mrnas raros) e melhora a especificidade de PCRS difíceis (por exemplo, 5' RACE).
12. PCR Descendente
A PCR descendente melhora a especificidade usando condições de recozimento apertadas para os primeiros ciclos de PCR.O ciclo começa a uma temperatura de recozimento aproximadamente 5℃ acima da Tm estimada, então cada ciclo é reduzido de 1℃ a 2℃ até que a temperatura de recozimento fique abaixo de Tm 5℃.Apenas o modelo de destino com a maior homologia será amplificado.Esses produtos continuam a se expandir nos ciclos subsequentes, expulsando os produtos inespecíficos amplificados.A PCR descendente é útil para métodos em que o grau de homologia entre o iniciador e o modelo alvo não é conhecido, como a impressão digital de DNA AFLP.
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