As transcriptases reversas tradicionais não toleram altas temperaturas (a temperatura ideal para a atividade de MMLV é de 37-50°C e AMV é de 42-60°C).O RNA viral mais complexo não pode ser efetivamente reverso transcrito em cDNA em baixas temperaturas, resultando em eficiência de detecção A redução.A RT-qPCR tradicional geralmente requer a participação de duas enzimas-chave (transcriptase reversa e DNA polimerase), o que impossibilita simplificar a operação do sistema de reação e reduzir o custo.Aqui, apresentaremos duas transcriptases reversas resistentes a altas temperaturas, TtH e RevTaq.Essas duas enzimas também têm a função de DNA polimerase, por isso são chamadas de enzimas bifuncionais.

TtH DNA polimerase

Você já deve ter ouvido falar do TtH, derivado da bactéria termofílica Thermus thermophilus HB8.Na presença de cátions bivalentes, como Mg2+, possui atividade de DNA polimerase.É amplamente utilizado em reações de PCR como a enzima Taq, mas tem maior resistência ao calor do que a enzima Taq, por isso também tem um efeito melhor na PCR com modelos de alto conteúdo de GC.

· Esta enzima basicamente não tem atividade de exonuclease 3'→5' e atividade de exonuclease 5'→3', por isso também pode ser usada para sequenciamento didesoxi.

· Esta enzima tem atividade RTase.Na presença de Mn2+, a atividade da RTase será aumentada.Usando esse recurso, ele pode ser usado para realizar reação de transcrição reversa e reação de PCR no mesmo tubo, ou seja, RT-PCR de uma etapa.No entanto, na presença de Mn2+, a precisão do RT-PCR não é alta.A atividade RT não tem nada a ver com a atividade da rnaase H.

· O aumento da atividade da Tth-DNA polimerase (pH9, ótimo +55℃～+70℃, máximo +95℃) supera os problemas causados ​​pela estrutura secundária do RNA.O cDNA resultante pode ser amplificado por PCR com a mesma enzima na presença de íons Mg2+.

· A capacidade da Tth-DNA polimerase de realizar transcrição reversa e amplificação de DNA em altas temperaturas torna essa enzima útil para RT-PCR quantitativo, clonagem e análise de expressão gênica de RNA celular e viral.
· Tth-DNA polimerase é usado para RT-PCR para amplificar o RNA até 1kb.

Características e vantagens

Tth DNA polimerase:

• Garantir o tamanho otimizado do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR), pelo menos 1000 pb na reação RT-PCR

• Aceita trifosfato de desoxirribonucleosídeo modificado como substrato

• Não relacionado à atividade de RNase H

• Possui alta estabilidade térmica para superar problemas, geralmente relacionados à alta estrutura secundária presente no RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimerase

Uma DNA polimerase resistente ao calor com atividade de transcriptase reversa

A RevTaq-RT-PCR-DNA polimerase é uma enzima altamente resistente ao calor e bifuncional com atividades de transcriptase reversa e polimerase de DNA obtidas por meio de evolução artificial e direcionada.

· A meia-vida da RevTaq RT-PCR DNA polimerase a 95°C é superior a 40 minutos.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase permite a transcrição reversa de alta temperatura diretamente do modelo de RNA, e a etapa de transcrição reversa pode ser repetida várias vezes para gerar mais modelos de cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase permite RT-PCR “zero-step” (sem etapa de transcrição reversa isotérmica), porque na etapa de extensão da PCR cíclica, a transcrição reversa e a amplificação do DNA ocorrem simultaneamente.Isso também promove a reação de transcrição reversa em altas temperaturas, minimizando assim os problemas encontrados na fusão da estrutura secundária forte no RNA em altas temperaturas.

· Devido à fórmula hot-start baseada em aptâmeros, RevTaq RT-PCR DNA polimerase produzirá melhores resultados quando a temperatura de recozimento e extensão for superior a 57°C.

· Uma vez que a enzima é resistente ao calor, recomenda-se projetar primers e sondas com pontos de fusão muito altos (>60°C).

· Recomenda-se otimizar a temperatura da etapa de recozimento/extensão através de um gradiente de temperatura durante o processo de configuração da reação.

· Quanto maior a temperatura, maior a especificidade da PCR.O ciclo de transcrição reversa é geralmente realizado a uma temperatura mais alta do que o ciclo de PCR, porque a hibridação DNA Primer:RNA Template geralmente tem um ponto de fusão mais alto do que DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase é geneticamente modificada e otimizada, e o tamanho do amplicon está entre 60-300 pb.

O limite de detecção da polimerase de DNA RevTaq RT-PCR atinge 4 cópias/

O sistema de reação otimizado (o estabelecimento de primers de alto ponto de fusão) é mostrado na figura.RevTaq RT-PCR RT-PCR acionado por DNA polimerase mostra melhor sensibilidade do que TaqPath 1-step RT-qPCR master mix, e menor gradiente de diluição da amostra de detecção.

Mais vantagens:

Função de início rápido → A etapa inicial de desnaturação térmica pode ser ignorada.

Fórmula de aptâmero de arranque a quente → Fornece 100% de atividade enzimática imediatamente e evita a amplificação não específica a baixas temperaturas (<57°C).

Função de clivagem → A etapa de extração de RNA é omitida, porque RevTaq RT-PCR DNA polimerase também pode processar amostras brutas de reação.Ele pode destruir imediatamente as membranas celulares de eucariotos, bactérias e vírus em um ciclo quente de RT-PCR.

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