Dicas para melhorar a recuperação da cola

1. Aumente a carga da amostra durante a eletroforese.

2. Use tampão de eletroforese recém-preparado.

3. Ao cortar a cola, tente cortar apenas a cola com tiras para reduzir o volume de corte da cola: não precisa de cola com poucos fragmentos de finalidade, caso contrário afetará a taxa de recuperação.

4. Depois de derreter dois ou mais pedaços de cola, use um tubo por maior que seja o volume e transfira para a mesma coluna.

5. A solução adicionada no sol pode ser um pouco mais, o que é mais propício para a ligação do DNA à membrana, mas geralmente não excede 750ul.

6. A chave para a recuperação do gel é ligar o DNA à coluna através da concentração de sal, acidez (carga) e hidrofobicidade da solução na coluna.Portanto, se o pH do tampão de eletroforese for muito alto, 10ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC) podem ser adicionados ao sol;a fim de interceptar melhor as moléculas de DNA na membrana, 30% de isopropanol pode ser adicionado para aquecer no líquido após a dissolução da cola.

7. Antes de adicionar o eluente, deixe a coluna em temperatura ambiente por alguns minutos (cerca de 10 minutos) para evaporar totalmente o etanol.

8. Finalmente, adicione menos eluente para minimizar o volume de recuperação.Geralmente, 30-50μl de eluente é usado para eluição (não muito pouco, caso contrário, não será capaz de molhar a membrana, o que não é propício à eluição);as gotículas de eluição estão no centro da membrana, para eluir totalmente o DNA ligado à membrana.

9. Depois de adicionar o eluente, ele pode ser eluído em banho-maria a 55 graus por 5 minutos ou colocado em banho-maria a 50 graus por mais de 10 minutos, ou selado com parafilme a 4 graus durante a noite e depois centrifugado para recuperação no dia seguinte, o efeito é bom.

10.Adicione o eluato centrifugado de volta à coluna de adsorção e centrifugue novamente.

Métodos e procedimentos detalhados para recuperação de produtos de PCR

1. Reciclagem de borracha comum

Se quiser recuperar a cola, o melhor é usar um kit, que é prático e tem uma taxa de recuperação um pouco maior.Se você realmente precisar recuperá-lo manualmente, pode adicionar 3 vezes o volume de TE após cortar a cola.Após a fusão em banho-maria, o fenol, o fenol/clorofórmio são extraídos de forma limpa e o etanol é precipitado.É isso.

2. Recuperação de DNA de géis de baixo ponto de fusão

Purificação de fragmentos de DNA Adicionar TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) igual ao volume do gel e colocar em banho-maria a 65°C por 5 minutos para dissolver o gel completamente.

Depois de atingir a temperatura ambiente, adicionou-se uma quantidade igual de fenol (saturado com TE, TE foi selado na camada superior e a camada inferior de fenol foi removida), e a mistura foi misturada suavemente (sem necessidade de mistura) e centrifugada a 12.000 rpm por 3 minutos.Repita 1-2 vezes.

Pegue o sobrenadante, adicione 0,1 volume de acetato de sódio 3mol/L (pH 5,2) e 2,5 vezes o volume de etanol absoluto para realizar a precipitação do etanol.Dissolva o DNA purificado com uma quantidade apropriada de TE, meça o conteúdo e prepare-o para uso (pode ser usado para análise da estrutura do gene alvo, preparação da sonda, etc.).

3. Recuperação de PCR com boa especificidade de amplificação

Se a especificidade da amplificação por PCR for boa, é apenas uma simples purificação e recuperação do produto de PCR.Você pode adicionar 50ug/ml de proteinase K ao produto de PCR, 37 graus por 1h, extrair uma vez com fenol/clorofórmio, extrair uma vez com clorofórmio e adicionar 0,1 volume do sobrenadante.O acetato de sódio foi recuperado por precipitação com 2,5 volumes de etanol absoluto.

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