Recentemente, descobri algo incrível!Muitos profissionais de experimentos avançados ao seu redor nem mesmo conhecem alguns pontos de conhecimento experimental muito básico.

Por exemplo, você pode responder às seguintes perguntas?

Existe alguma diferença entre OD260 e A260?O que cada um significa?
OD é a abreviação de densidade óptica (densidade óptica), A é a abreviação de absorbância (absorvância), os dois conceitos são realmente os mesmos, “densidade óptica” é “absorvância”, mas “densidade óptica” está de acordo com a maioria dos padrões nacionais e mais padronizados.

Normalmente medimos o valor de OD em 260 nm para calcular a concentração de ácido nucleico, então o que 1OD representa?
O ácido nucleico tem um pico máximo de absorção em um comprimento de onda de 260nm, que contém DNA e RNA, bem como fragmentos de ácido nucleico fragmentados (este é o ponto chave).
O valor OD medido em um comprimento de onda de 260 nm foi registrado como OD260.Se a amostra for pura, o valor OD260 pode calcular a concentração da amostra de ácido nucleico.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (DNA de fita dupla)
=37 μg/ml ssDNA (DNA de fita simples)
=40 μg/ml ARN
=30 μg/ml dNTPs (oligonucleótidos)
Existe alguma conexão e diferença entre RT-PCR, Realtime-PCR e QPCR?
RT-PCR é a abreviação de PCR de Transcrição Reversa
Real Time PCR=qPCR, abreviação de Quantitative Real Time PCR
Embora o PCR em tempo real (PCR quantitativo fluorescente em tempo real) e o PCR de transcrição reversa (PCR de transcrição reversa) pareçam ser abreviados como RT-PCR.Mas a convenção internacional é: RT-PCR refere-se especificamente à PCR de transcrição reversa.

Quais são os nt, bp e kb comumente usados ​​para descrever o comprimento do DNA/RNA em biologia?
nt = nucleotídeo
bp = par base par base
kb = quilobase

Claro, você diria que muitas pessoas não se importam com esses pequenos detalhes!Todo mundo faz isso e ninguém vai perguntar o que é.Você sabe que isso é desnecessário, certo?

Não, não, não, é muito necessário saber disso!por causa de quê?
Porque você quer postar um artigo!Irmão!Esteja você almejando a graduação ou buscando conquistas em pesquisas científicas, você deve contar com artigos para falar!

A extração de ácidos nucleicos deve ser o experimento mais simples e básico.A qualidade da extração de ácidos nucleicos determina diretamente os resultados dos experimentos subsequentes.

Embora eu tenha dito isso muitas vezes, ainda há muitos amigos que não se importam.Desta vez decidi sair do artigo!

Informações mínimas para publicação de experimentos quantitativos de PCR em tempo real, referidos como MIQE, é um conjunto de diretrizes de experimento quantitativo de fluorescência lançado internacionalmente, que propõe padrões mínimos para as informações experimentais necessárias para avaliar experimentos de PCR quantitativo de fluorescência e publicar artigos.Através das condições experimentais e métodos de análise fornecidos pelo experimentador, os revisores podem avaliar melhor a validade do esquema experimental do pesquisador.

Pode-se ver que na seção de extração de ácido nucleico, os seguintes itens de detecção foram propostos,

“E” indica informações que devem ser fornecidas e “D” indica informações que devem ser fornecidas se necessário.

O formulário é muito complicado, na verdade, quero dizer que todos precisam começar de

pureza (D), rendimento (D), integridade (E) e consistência (E) para avaliar os ácidos nucleicos nesses quatro aspectos.

De acordo com os hábitos experimentais, primeiro fale sobre os métodos de avaliação de pureza e concentração.

A medição de OD é o método de detecção favorito e mais fácil para os experimentadores.Quanto ao princípio, não vou entrar em detalhes aqui.Muitos laboratórios agora usam espectrofotômetros ultramicro para analisar quantitativamente amostras de ácido nucleico diretamente.Ao exibir o valor de absorbância, o programa fornece diretamente o valor da concentração (ácido nucleico, proteína e corante fluorescente) e as proporções relacionadas.Quanto à análise do valor OD, salve esta imagem e você ficará bem.

Lista de solução de valor OD universal

No entanto, existem algumas advertências que precisam ser apresentadas separadamente para você.

(Afinal, sei que devem ser vocês que economizam e esperam até precisar deles!)

Nota 1 Equipamento

O valor OD será afetado por diferentes equipamentos.Desde que o OD260 esteja dentro de um determinado intervalo, os valores de OD230 e OD280 são significativos.Por exemplo, a faixa de absorção do Eppendorf D30 comum em 260 nm é 0~3A, e o NanoDrop One do Thermo está em 260 nm.A faixa de absorção de 0,5~62,5A.

Nota 2Reagente de diluição

O valor de DO pode ser afetado pela diluição de diferentes reagentes.Por exemplo, a leitura OD260/280 de RNA purificado em pH7,5 10mM trisbuffer está entre 1,9-2,1, enquanto emsolução aquosa neutraa proporção será menor, talvez apenas 1,8-2,0, mas isso não significa que a qualidade do RNA mude Diferença.

Nota 3Substâncias residuais

A existência de substâncias residuais afetará a precisão da medição da concentração de ácidos nucleicos, por isso é necessário evitar ao máximo resíduos de proteínas, fenóis, polissacarídeos e polifenóis nas amostras de ácidos nucleicos.

Porém, de fato, a extração com reagentes orgânicos é um método antigo.Em kits comerciais, o efeito de extração pode ser alcançado através de uma coluna de adsorção à base de sílica combinada com centrifugação, evitando reagentes orgânicos tóxicos e nocivos, difíceis de remover, etc.O kit de extração de ácido nucleico da Foregene, não usa DNase/RNase e reagentes orgânicos tóxicos durante toda a operação, rápido e seguro, e aefeito ébom(disse sem querer que era careca, mas sei que quer saber).

Exemplo 1: Rendimento e pureza da extração de DNA genômico

O Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) trata amostras de solo de várias fontes, e a quantidade e a pureza do DNA genômico obtido são mostradas na tabela a seguir:
Exemplo 2: Rendimento e pureza da extração de RNA tecidual

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) processou várias amostras de tecido, e a quantidade e a pureza do RNA obtido são mostradas na tabela abaixo (para tecido de camundongo):
No entanto, não pense que você acabou com o valor OD.Você tem algum cuidado com os pontos-chave que desenhei para você na frente?

Perceber

Moléculas fragmentadas de ácido nucléico também serão calculadas na absorbância.Supondo que você tenha resíduos de DNA genômico no RNA, seu valor de OD parecerá muito alto, mas a concentração real de RNA não pode ser determinada.Se o seu RNA é Não está claro se há degradação, então ainda precisamos de um método de avaliação abrangente para dar um julgamento mais preciso, ou seja, a avaliação da integridade do ácido nucleico mencionada no MIQE.