O experimento RT-qPCR inclui extração de RNA e avaliação de qualidade, transcrição reversa e qPCR três etapas, cada etapa tem muitas precauções, apresentaremos em detalhes abaixo.

Ⅰ.Avaliação da qualidade do RNA

No experimento RT-qPCR, após a conclusão da extração do RNA, a qualidade do RNA precisa ser avaliada, e o experimento de acompanhamento só pode ser realizado após a qualificação.Os métodos de avaliação incluem espectrofotômetro, eletroforese em gel Agilent, análise Agilent 2100, entre os quais o espectrofotômetro mais comumente usado e detecção do método de eletroforese em gel de agarose.Deve-se notar que esses dois métodos precisam ser usados ​​juntos para completar a detecção e análise da concentração, pureza e integridade do RNA, de modo a garantir a qualidade do RNA.

Kit de isolamento de RNA relacionado: 

Kit de isolamento de RNA total da célula

RNA total altamente purificado e de alta qualidade pode ser obtido a partir de várias células cultivadas em 11min.

Kit de isolamento de RNA total animal

Extraia rápida e eficientemente RNA total de alta pureza e alta qualidade de vários tecidos animais.

Espectrofotômetro:

O espectrofotômetro é usado principalmente para determinar a concentração e a pureza do RNA, mas não pode detectar a integridade do RNA e do resíduo genômico.Entre eles, A260/280 e A260/230 são parâmetros importantes para detecção de pureza de RNA, e a pureza de RNA pode ser detectada de acordo com a flutuação de seus valores:

1. 1.9< A260/280< 2.1, indicando que a pureza do RNA é boa;A260/280<1,9, indicando que pode haver resíduo de proteína no RNA;A260/280>2.1, indicando possível degradação parcial do RNA, que pode ser posteriormente confirmada por eletroforese em gel de agarose.

2. 2,0< A260/230< 2,2, indicando que a pureza do RNA é boa;A260/230< 2,0, indicando que pode haver resíduos de reagentes orgânicos no RNA, como fenóis, etanol ou açúcares.

Eletroforese em gel de agarose:

O ensaio de eletroforese em gel de agarose pode analisar a integridade do RNA, genoma e resíduos de proteínas, mas não pode quantificar com precisão a concentração de RNA ou detectar os resíduos de reagentes orgânicos.Tome modelos de RNA eucarióticos, por exemplo:

1. O RNA foi submetido a eletroforese em gel de agarose.Se houvesse apenas três bandas únicas de 28sRNA, 18sRNA e 5.8sRNA no mapa de gel, isso indica que o RNA extraído está intacto.Se houver um fenômeno de arrasto, indica degradação parcial do RNA.

2. Se houver uma única banda brilhante entre o orifício de cola e a banda 28sRNA, pode haver resíduo de DNA genômico.

3. Se aparecerem faixas no orifício da cola, isso indica que pode haver resíduos de proteínas e outras substâncias macromoleculares.

Ⅱ. Transcrição reversa

Após a conclusão da extração de RNA, ele precisa ser revertido em cDNA para experimentos subsequentes, portanto, a etapa de reversão é essencial.A transcrição reversa será introduzida a partir da seleção da transcriptase reversa e primer:

Seleção da transcriptase reversa:

As transcriptases reversas típicas incluem AMV RTase e MMLV RTase.A RNase H da AMV RTase tem forte atividade, curto comprimento de síntese, baixa quantidade de síntese e boa estabilidade térmica (42 ~ 55 ℃).A atividade da RNase H da MMLV RTase é fraca, o comprimento da síntese é longo, a quantidade de síntese é alta e a estabilidade térmica é ruim (37 ~ 42 ℃).

Como a enzima RNase H tem a função de degradar o modelo de RNA, o MMLV com atividade RNase H fraca deve ser preferencialmente selecionado durante a transcrição reversa e, após a engenharia genética posterior, a estabilidade térmica do MMLV atingiu um salto qualitativo.Tomando ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV para transcrição reversa) por exemplo, é uma nova transcriptase reversa expressa em bactérias E. coli manipuladas usando tecnologia de recombinação genética.É uma polimerase de DNA recombinante que sintetiza uma fita de DNA complementar a partir de RNA de fita simples, DNA ou um híbrido de RNA:DNA.Não possui atividade de RNase H, forte estabilidade, forte afinidade de RNA e alta sensibilidade de detecção.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV para transcrição reversa)

Seleção de primer:

Geralmente, os primers RT se enquadram em três categorias: oligo dT, primers aleatórios e primers específicos de gene.Selecione primers adequados para uso de acordo com diferentes requisitos experimentais.

1. Se o modelo for de origem eucariótica e o cDNA tardio for usado para amplificação de PCR de rotina, Oligo (dT) é recomendado;Se o experimento subsequente for usado apenas para qPCR, Oligo (dT) é recomendado para ser misturado com primers aleatórios para melhorar a eficiência da transcrição reversa.

2. Se o modelo for de procariotos, os primers aleatórios ou os primers específicos do gene devem ser selecionados para a transcrição reversa.

Ⅲ.qPCR

A quantificação de fluorescência é elaborada principalmente a partir da seleção de métodos quantitativos, princípios de design de primer, seleção de ROX, configuração do sistema de reação e configuração das condições de reação, etc.

Seleção de métodos quantitativos:

Os métodos quantitativos são divididos em métodos quantitativos relativos e métodos quantitativos absolutos.A quantificação relativa pode ser usada para detectar o efeito de certos métodos de tratamento na expressão gênica, detectar a diferença de expressão gênica em momentos diferentes e comparar a diferença de expressão gênica em diferentes tecidos.A quantificação absoluta pode detectar a quantidade de ácido nucleico no vírus e assim por diante.Ao fazer experimentos, devemos escolher os métodos quantitativos apropriados de acordo com nossos próprios experimentos.

Princípios de design do primer:

O design do primer para qPCR está diretamente relacionado à eficiência da amplificação e especificidade do produto.Portanto, projetar corretamente bons primers é o primeiro passo para uma qPCR bem-sucedida.No design do primer, os seguintes princípios devem ser observados ao atender ao princípio do design do primer convencional:

1. O comprimento do fragmento alvo é controlado entre 100 e 300 pb;

2. Design de exon cruzado para evitar a influência do DNA genômico;

3. Os primers projetados precisam ser testados quanto à eficiência de amplificação, e somente quando a eficiência de amplificação atingir o padrão (90-110%) eles poderão ser usados ​​para experimentos quantitativos;

4. A concentração do primer é geralmente otimizada entre 0,1uM e 1,0uM.

Seleção deROX:

No processo de reação quantitativa, ROX pode ajustar a diferença de caminho óptico, erro de pipetagem ou diferença de volume causada por evaporação e condensação uniformemente, melhorando a repetibilidade dos resultados.No entanto, deve-se notar que a seleção do ROX está relacionada ao instrumento.Se o instrumento qPCR tiver a função de corrigir automaticamente a diferença entre furos, não precisa adicionar ROX;caso contrário, ele precisa adicionar a correção ROX.Pequenos parceiros na compra de reagentes devem estar de acordo com o instrumento utilizado para escolher o ROX correto, evitando erros posteriores.

Preparação do sistema de reação:

Volumes de reação de 20 ul e 50 ul são preferidos.Os seguintes pontos devem ser levados em consideração quando o sistema for formulado:

1. O sistema de reação precisa ser preparado por ventilação na bancada ultralimpa, novo ddH₂O é usado para cada experimento;

2. Cada experimento precisa preparar NTC para verificar se há poluição no sistema, e todo par de primers precisa fazer NTC ao preparar o sistema;

3. Para detectar se há resíduo de gDNA no molde de RNA, NRT pode ser preparado para cada amostra para detecção;

4. Ao preparar o sistema, recomenda-se fazer pelo menos 3 repetições técnicas para uma amostra;

5. Quando o modelo é cDNA, recomenda-se diluir 5-10 vezes para reduzir o efeito de inibição do sistema de transcrição reversa no experimento qPCR.É melhor explorar a quantidade do gabarito por gradiente, para que o valor do CT fique entre 20-30;

6. Determine o número necessário de reações, aumente de 5 a 10% com base no número de reações e calcule o número de configuração do volume;

7, o sistema é preparado usando o princípio de pré-mistura, misturando após a centrifugação e garantindo que não haja bolhas;

8, na medida do possível, escolha os consumíveis de suporte.

Kit RT-qPCR Relacionado