Todo mundo está falando sobre o princípio do experimento qRT-PCR, design de primer, interpretação de resultados, etc., mas acho que devo compartilhar com você a operação experimental de qRT-PCR.É pequeno, mas é sobre resultados.
Antes de fazer qRT-PCR, precisamos ter uma compreensão clara de nosso próprio RNA e métodos de operação.Afinal, nossos esforços estão voltados para a obtenção de resultados, e não apenas para a prática.Portanto, antes de fazer o qRT-PCR, precisamos determinar os seguintes problemas (alguns dos quais são aplicáveis apenas ao SYBR).
1 Tem certeza que seu RNA não está degradado?
O NanoDrop 2000 só pode detectar a concentração e a pureza do RNA, mas não pode detectar a integridade do RNA.
O valor de RNA (RNA Intesity Number) pode refletir a integridade do RNA, que é detectado pelo sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagrama esquemático dos valores de RIN para diferentes amostras de RNA (eucariontes)
No entanto, os laboratórios geralmente não possuem o Agilent 2100 Bioanalyzer.Nesse caso, podemos detectar através do gel de formaldeído, mas a exigência da quantidade total de RNA é alta, então o método mais rápido é usar a eletroforese em gel comum.É necessário estar em um ambiente livre de nuclease, portanto, é necessário enxaguar o tanque de eletroforese, frasco de sol, suporte de gel e pente com água DEPC.A agarose também é livre de nuclease (desde que recém-aberta), e o Loading Buffer deve ser aberto o mais fresco possível, com 1,2% de gel.
Observe que o gel deve estar completamente dissolvido, caso contrário, causará bandas não homogêneas, conforme mostrado na amostra 9 da figura.Se a voltagem for muito alta ou funcionar por muito tempo irá gerar calor e causar a degradação do RNA, então a voltagem e o tempo devem ser controlados razoavelmente.Além disso, a execução do gel também pode determinar se há resíduo de DNA na amostra e observar se há um grande número de bandas retidas no poço de distribuição.
Figura.Detecção de eletroforese em gel de RNA
2 Você tem certeza sobre a concentração do seu cDNA?
A experiência dos irmãos mais velhos no laboratório é que o cDNA do sistema de 20 ul obtido por cada inversão é diretamente diluído 20X, enquanto as pós-doutoras são diluídas 10X.Eu geralmente dependo da situação.Como a qualidade do RNA mencionado por cada pessoa é diferente, o nível de reversão também é diferente e a tecnologia de reversão pode não ser estável.
Portanto, toda vez que recebo o cDNA reverso, primeiro o diluo cerca de 3 vezes e, em seguida, uso o gene de limpeza para fazer RT-PCR, o número de ciclos geralmente é de 25 ciclos, para identificar a concentração específica e, em seguida, determinar o fator de diluição final.
3 Tem certeza de que seus primers são fáceis de usar?
Ele pode passar pela curva de fusão do qRT-PCR, mas isso ainda custa dinheiro.Para laboratórios sem muito dinheiro, quando pegam muitos primers, podem usar o RT-PCR comum para ver se é banda única e identificar a especificidade dos primers.Se o laboratório não estiver com falta de dinheiro, a especificidade de todos os primers pode ser identificada uma vez através da curva de fusão.
4 Você tem certeza de que suas condições experimentais são adequadas?
O SYBR deve ser protegido de luz forte, portanto, tente desligar a luz do teto ao adicionar o reagente SYBR e use apenas luz fraca para completá-lo.
Armazenar SYBR a 4°C.Quando em uso, inverta suavemente para cima e para baixo para misturar bem para evitar a formação de espuma e não vórtice vigorosamente.
Algumas irmãs mais novas gostam de fazer marcas na placa de PCR por medo de misturar as amostras, o que é errado.Como é muito provável que seus marcadores afetem a coleta de sinais fluorescentes, geralmente recomendo que os juniores usem cadernos experimentais para auxiliar na memória, conforme mostrado abaixo.
Figura.Diagrama de carregamento de amostra qRT-PCR
5 Tem certeza de que está fazendo certo?
Certifique-se de usar luvas, use luvas, use luvas e diga coisas importantes três vezes.
Para reduzir a exposição do SYBR à luz, eu pessoalmente gosto de adicionar um modelo primeiro, conforme mostrado na figura abaixo.De acordo com a experiência, a adição de uma pequena quantidade de molde pode causar erros de amostragem.Portanto, para minimizar o erro causado pela adição de uma pequena quantidade de molde, costumo dobrar a amostra novamente e dobrar a quantidade ao adicionar a amostra para reduzir a quantidade de H2O2 adicionada.
Figura.Diagrama esquemático do carregamento qRT-PCR
Em seguida, configure o sistema qRT-PCR da seguinte maneira.
Figura.Diagrama de preparação do sistema qRT-PCR
NOTA: O processo de configuração precisa ser feito no gelo.
Depois de adicionar a amostra, cole o filme de vedação transparente.Tente não tocar a superfície do filme de vedação transparente com as mãos, apenas opere a partir do espaço em ambos os lados do filme.Porque as impressões digitais também podem afetar a coleta de sinais fluorescentes.Em seguida, use uma centrífuga para centrifugar rapidamente por 10 s em baixa velocidade para evitar que a amostra fique pendurada na parede.
Produtos relacionados:
Horário de postagem: 28 de abril de 2023
