Máquina de PCR|Você realmente entende?

Tecnologia de PCR ganhadora do Prêmio Nobel

Em 1993, o cientista americano Mulis recebeu o Prêmio Nobel de Química e sua conquista foi a invenção da tecnologia PCR.A mágica da tecnologia de PCR está nas seguintes características: Em primeiro lugar, a quantidade de DNA a ser amplificada é extremamente pequena e, teoricamente, uma molécula pode ser usada para amplificação;em segundo lugar, a eficiência de amplificação é alta e a quantidade do gene alvo é exponencial.Amplificação, mais de 10 milhões de vezes em poucas horas.Agora, o instrumento de PCR tem sido amplamente utilizado na pesquisa de ciências da vida e em muitos outros aspectos.

Diferentes modelos e fabricantes de termocicladores podem apresentar desempenho e repetibilidade diferentes.Essas diferenças afetam não apenas a eficiência da PCR, mas também a precisão e a consistência dos dados obtidos.Entender os recursos da máquina de PCR pode nos ajudar a maximizar o sucesso de nossos experimentos.

módulo de aquecimento

A precisão da temperatura do termociclador pode ser decisiva para o sucesso ou falha da PCR.A consistência de temperatura de poço a poço no bloco de aquecimento também é crítica para obter resultados de PCR confiáveis ​​e reprodutíveis.

Uma maneira de garantir a precisão térmica é testar com frequência usando kits de verificação de temperatura e recalibrar conforme necessário por um profissional treinado.Os testes de verificação de temperatura são normalmente usados ​​para:

Precisão de poço a poço em relação à temperatura definida no modo isotérmico

Precisão de poço a poço em relação à temperatura definida após a conversão de temperatura

Precisão da temperatura da tampa térmica

Controle de temperatura de recozimento de primer

O controle de temperatura gradiente é uma função do instrumento de PCR que facilita a otimização do recozimento do primer na PCR.O objetivo da configuração do gradiente é atingir temperaturas variadas entre os módulos e, com aumento e queda de temperatura ≥2°C entre cada coluna, diferentes temperaturas podem ser testadas simultaneamente para obter a temperatura ideal de recozimento do primer.Teoricamente, um verdadeiro gradiente atinge a temperatura linear entre os módulos.

No entanto, os termocicladores de gradiente convencionais normalmente empregam um único bloco térmico e controlam a temperatura por meio de dois elementos de aquecimento e resfriamento localizados em ambas as extremidades, geralmente resultando nas seguintes limitações:

Apenas duas temperaturas podem ser definidas: as temperaturas alta e baixa para recozimento de primer são definidas em ambas as extremidades do módulo térmico, e a configuração precisa de outras temperaturas não pode ser alcançada entre o módulo

Devido à troca de calor entre as diferentes colunas, é mais provável que a temperatura entre as diferentes regiões do módulo siga uma curva sigmoidal em vez de um verdadeiro gradiente linear.

Temperatura da amostra

A capacidade do termociclador de controlar a temperatura da amostra é muito importante para a precisão dos resultados da PCR.Parâmetros específicos do instrumento, como taxas de rampa, tempos de espera e algoritmos, são essenciais para prever a temperatura da amostra.

A taxa de aquecimento e resfriamento da máquina de PCR significa que a temperatura muda entre as etapas de PCR que ocorrem durante um determinado período de tempo.Como leva um certo tempo para que o calor seja transferido do módulo para a amostra, a taxa real de aquecimento e resfriamento da amostra será mais lenta.Portanto, a definição de velocidade de mudança de temperatura precisa ser distinguida e compreendida.

A taxa de rampa máxima ou de pico do módulo representa a mudança de temperatura mais rápida que o módulo pode atingir em um período de tempo muito pequeno durante a rampa.

A taxa média de rampa do bloco representa a taxa de mudança de temperatura durante um período de tempo mais longo e fornecerá uma medida mais representativa da velocidade da máquina de PCR.

A taxa máxima de aquecimento e resfriamento da amostra e a taxa média de aquecimento e resfriamento da amostra refletem a temperatura real obtida pela amostra.A taxa de aquecimento e resfriamento da amostra fornecerá uma comparação mais precisa do desempenho da máquina de PCR e seu impacto potencial nos resultados da PCR.

Ao realizar uma substituição do ciclador, recomenda-se usar um instrumento com um programa de taxa de rampa que simule o modo anterior para facilitar a substituição e minimizar o impacto na repetibilidade da PCR.

O termociclador deve ser projetado para intervalos de tempo somente após a amostra atingir a temperatura definida.Desta forma, o tempo que a amostra é mantida na temperatura definida será mantido com mais precisão com as condições de ciclo correspondentes exigidas no procedimento operacional.

Os termocicladores costumam usar algoritmos matemáticos complexos para garantir que as amostras possam atingir rapidamente uma temperatura definida de acordo com um programa predefinido.Com base no volume do sistema de reação e na espessura dos plásticos de PCR usados, o algoritmo pode prever a temperatura da amostra e o tempo que levará para atingir a temperatura definida.Baseando-se nesses algoritmos, durante o processo de aquecimento ou resfriamento do termociclador, a temperatura do bloco normalmente excederá o valor definido por meio de um processo chamado overshoot ou undershoot do bloco térmico.Essa configuração garante que a amostra atinja a temperatura definida o mais rápido possível, sem ultrapassar ou ultrapassar o limite.

Rendimento experimental

Os fatores que podem aumentar o rendimento de um termociclador incluem taxas de rampa, configurações de bloqueio térmico e integração de plataformas de automação.

A taxa de aquecimento e resfriamento do termociclador representa a velocidade na qual ele atinge a temperatura definida.Quanto mais rápido o aumento e a queda da temperatura, mais rápido o PCR será executado, o que significa que mais experimentos podem ser concluídos em um determinado período de tempo.Além disso, os experimentos podem ser acelerados usando polimerases de DNA mais rápidas.

O design do módulo termociclador também é crucial para experimentos de PCR.Por exemplo, módulos substituíveis permitem flexibilidade no número de amostras por execução.Além disso, os módulos de aquecimento com módulos controláveis ​​individualmente são ideais para executar diferentes programas de PCR simultaneamente em um termociclador.

Para PCR automatizado de alto rendimento, o software que controla o sistema de manipulação de pipetagem deve ser programável e compatível.Os sistemas automatizados são ideais para realizar reações de PCR de alto rendimento porque podem ser executados continuamente com pouca intervenção humana, minimizando assim o tempo necessário para a configuração experimental manual e aumentando o número de reações em um determinado período de tempo.

Confiabilidade, Durabilidade e Garantia de Qualidade de Termocicladores

Além dos recursos de desempenho e rendimento, a máquina de PCR também deve ser capaz de resistir a certos usos repetidos, estresse ambiental e condições de transporte.Alguns fabricantes podem relatar como o instrumento realiza testes de confiabilidade e durabilidade.A detecção do instrumento de PCR correspondente inclui:

Confiabilidade: Equipamentos mecânicos são usados ​​para realizar testes repetidos em componentes de instrumentos usados ​​com frequência, como tampas térmicas, painéis de controle/telas sensíveis ao toque e módulos de ciclos de temperatura.

Pressão ambiente: As câmaras ambientais podem ser utilizadas para simular diferentes condições de experimentos de rotina, como temperatura, umidade.

Teste de envio: Testes intensos de choque e vibração podem ser realizados de acordo com os padrões da International Safety Shipping Association para garantir que o instrumento chegue em condições de operação sem danos.

Garantia e serviço de manutenção da máquina PCR

Apesar dos rigorosos testes de confiabilidade e durabilidade, os termocicladores inevitavelmente têm problemas técnicos durante a vida útil do instrumento.Para sua tranquilidade, a garantia, o serviço e a manutenção do fabricante devem ser considerados ao comprar um instrumento.

A flexibilidade de serviços como manutenção no local/retorno à fábrica, serviços de monitoramento remoto e substituição de instrumentos no processo de manutenção, etc., para reduzir o impacto na eficiência do trabalho.

A duração do período de garantia, o tempo de resposta do serviço, a acessibilidade do suporte técnico e as habilidades do pessoal de suporte profissional.

Viabilidade de instalação, operação, cooperação e verificação de instrumentos para atender aos requisitos laboratoriais e regulamentares relacionados.Serviços de manutenção, como verificação de temperatura, teste e calibração, estão disponíveis para garantir que o instrumento funcione adequadamente com os parâmetros correspondentes.

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