A PCR é a tecnologia de amplificação de ácido nucleico mais amplamente utilizada e é amplamente utilizada devido à sua sensibilidade e especificidade.No entanto, a PCR requer desnaturação térmica repetida e não pode se livrar das limitações de contar com instrumentos e equipamentos, o que limita sua aplicação em testes clínicos de campo.

Desde o início da década de 1990, muitos laboratórios começaram a desenvolver tecnologia de amplificação de temperatura constante que não requer desnaturação térmica.Agora eles desenvolveram tecnologia de amplificação isotérmica mediada por loop, tecnologia de amplificação isotérmica de substituição de fita, tecnologia de amplificação isotérmica de círculo rolante e dependência de sequência de ácido nucleico.Tecnologia de amplificação isotérmica e outras tecnologias. 

Lamplificação isotérmica mediada por oop

O princípio da amplificação é baseado no fato de que o DNA está em um estado de equilíbrio dinâmico a cerca de 65°C.Quando qualquer iniciador é pareado e estendido para a parte complementar do DNA de fita dupla, a outra fita se dissociará e se tornará uma fita simples.

A essa temperatura, o DNA usa 4 primers específicos para contar com uma polimerase de DNA de deslocamento de fita para fazer a síntese de DNA de deslocamento de fita autocircular continuamente.

Primeiro determine as 6 regiões específicas F3, F2, F1, B1, B2, B3 no gene alvo e, em seguida, projete 4 primers com base nessas 6 regiões específicas (como mostrado na figura abaixo):

O primer interno dianteiro (FIP) é composto de F1c e F2.

O primer interno inverso (BIP) é composto de B1c e B2, e TTTT é usado como espaçador no meio.

Os primers externos F3 e B3 são respectivamente compostos pelas regiões F3 e B3 no gene alvo.

No sistema de reação LAMP, a concentração do primer interno é várias vezes a do primer externo.O iniciador interno é primeiro combinado com a fita molde para sintetizar uma fita complementar para formar uma fita dupla de DNA.Posteriormente, o primer externo é combinado com a fita molde para formar uma fita dupla de DNA.Sob a ação da BstDNA polimerase, a fita complementar sintetizada pelo primer interno é liberada.Após uma série de reações, a fita complementar finalmente forma uma única fita de DNA com uma estrutura de haltere.

A própria fita simples de DNA de estrutura em halteres é usada como um modelo para formar continuamente um DNA de estrutura de haste-alça transicional com uma extremidade aberta.Os primers interno e externo orientam o DNA da estrutura de haste-alça de transição para sofrer continuamente deslocamento de fita e reações de extensão e, finalmente, formar múltiplas estruturas de haste-alça com diferentes comprimentos.mistura de DNA.

Vantagens e desvantagens da amplificação isotérmica mediada por loop

Vantagens da LÂMPADA:

(1) Alta eficiência de amplificação, que pode efetivamente amplificar de 1 a 10 cópias do gene alvo em 1h, e a eficiência de amplificação é de 10 a 100 vezes maior que a da PCR comum.

(2) O tempo de reação é curto, a especificidade é forte e nenhum equipamento especial é necessário.

Deficiências do LAMP:

(1) Os requisitos para primers são particularmente altos.

(2) O produto amplificado não pode ser usado para clonagem e sequenciamento, mas apenas para julgamento.

(3) Devido à sua forte sensibilidade, é fácil formar aerossóis, causando falsos positivos e afetando os resultados do teste.

Samplificação de deslocamento trand

Amplificação de deslocamento de cadeia (SDA) é uma técnica de amplificação de DNA isotérmica in vitro baseada na reação enzimática proposta pela primeira vez pelo estudioso americano Walker em 1992.

O sistema básico de SDA inclui uma endonuclease de restrição, uma DNA polimerase com atividade de deslocamento de fita, dois pares de primers, dNTPs e íons de cálcio e magnésio e sistemas tampão.

O princípio da amplificação por deslocamento de cadeia baseia-se na sequência de reconhecimento da endonuclease de restrição quimicamente modificada em ambas as extremidades do ADN alvo.A endonuclease abre a lacuna na fita de DNA em seu local de reconhecimento, e a DNA polimerase estende a lacuna 3' End e substitui a próxima fita de DNA.

As fitas simples substituídas de DNA podem ser combinadas com primers e estendidas em fitas duplas pela DNA polimerase.Este processo é repetido continuamente, para que a sequência alvo seja amplificada de forma eficiente.

Vantagens e desvantagens da tecnologia de amplificação de deslocamento de fita

Vantagens do SDA:

A eficiência de amplificação é alta, o tempo de reação é curto, a especificidade é forte e nenhum equipamento especial é necessário.

Deficiências do SDA:

Os produtos não são uniformes, e alguns produtos de fita simples e dupla são sempre produzidos no ciclo SDA, e a cauda inevitavelmente ocorrerá quando detectada por eletroforese.

Ramplificação do círculo ondulante

A amplificação por círculo rolante (RCA) é proposta com base no método de cópia de DNA de organismos patogênicos por círculo rolante.Refere-se ao uso de DNA circular de fita simples como modelo a uma temperatura constante e uma polimerase de DNA especial (como Phi29) ) Sob a ação da síntese de DNA de círculo rolante para alcançar a amplificação do gene alvo.

A RCA pode ser dividida em amplificação linear e amplificação exponencial.A eficiência do RCA linear pode chegar a 10⁵vezes, e a eficiência do RCA exponencial pode chegar a 10⁹vezes.

Distinção simples, como mostrado na figura abaixo, a amplificação linear a usa apenas 1 primer, a amplificação exponencial b tem 2 primers.

O RCA linear também é chamado de RCA de primer único.Um primer se liga ao DNA circular e é estendido pela ação da DNA polimerase.O produto é um único filamento linear com um grande número de sequências repetitivas milhares de vezes o comprimento de um único loop.

Como o produto do RCA linear está sempre conectado ao primer de partida, a facilidade de fixação do sinal é uma grande vantagem.

RCA exponencial, também conhecido como hiper amplificação ramificada HRCA (Hyper branched RCA), na RCA exponencial, um primer amplifica o produto RCA, o segundo primer hibridiza com o produto RCA e se estende, e a substituição já está ligada ao produto RCA Os primers downstream estendem a fita e repetem extensão e substituição para produzir um produto de amplificação RCA dendrítico.

As vantagens e desvantagens da amplificação de ácido nucleico em círculo rolante

Vantagens do RCA:

Alta sensibilidade, boa especificidade e fácil operação.

Deficiências do RCA:

Problemas de segundo plano durante a detecção de sinal.Durante a reação RCA, a sonda cadeado não circulada e o DNA ou RNA modelo da sonda não ligada podem gerar alguns sinais de fundo. 

Namplificação baseada em sequência de ácido ucleico

A amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos (NASBA) é uma nova tecnologia desenvolvida com base na PCR.É uma amplificação contínua e isotérmica de ácidos nucleicos guiada por um par de primers com uma sequência promotora de T7.A tecnologia pode amplificar o RNA molde em cerca de 109 vezes em cerca de 2 horas, o que é 1000 vezes mais do que o método de PCR convencional e não requer equipamentos especiais.

Essa tecnologia tem sido usada para diagnóstico rápido de doenças assim que surgiu, e muitas empresas atualmente usam esse método em kits de detecção de RNA.

Embora a amplificação de RNA também possa usar a tecnologia de PCR de transcrição reversa, a NASBA tem suas próprias vantagens: pode ser realizada sob condições de temperatura relativamente constantes e é mais estável e precisa do que a tecnologia de PCR tradicional.

A reação ocorre a 41 graus Celsius e requer transcriptase reversa AMV (vírus da mieloblastose aviária), RNase H, T7 RNA polimerase e um par de primers para ser concluída.

O processo inclui principalmente:

O forward primer contém a sequência complementar do promotor T7.Durante a reação, o primer direto se liga à fita de RNA e é catalisado pela enzima AMV para formar uma fita dupla de DNA-RNA.

A RNase H digere o RNA na fita dupla híbrida e retém o DNA de fita simples.

Sob a ação do primer reverso e da enzima AMV, forma-se uma fita dupla de DNA contendo a sequência promotora de T7.

Sob a ação da T7 RNA polimerase, o processo de transcrição é concluído e uma grande quantidade de RNA alvo é produzida.

Vantagens do NASBA:

(1) Seu primer possui uma sequência promotora de T7, mas o DNA estranho de fita dupla não possui sequência promotora de T7 e não pode ser amplificado, portanto, esta tecnologia possui alta especificidade e sensibilidade.

(2) NASBA incorpora diretamente o processo de transcrição reversa na reação de amplificação, encurtando o tempo de reação.

Desvantagens do NASBA:

(1) Os componentes da reação são mais complicados.

(2) São necessários três tipos de enzimas para aumentar o custo da reação.