PCR em tempo real, também conhecido como PCR quantitativo ou qPCR, é um método para monitoramento e análise em tempo real de produtos de amplificação de PCR.
Como o PCR quantitativo tem as vantagens de operação simples, rápida e conveniente, alta sensibilidade, boa repetibilidade e baixa taxa de contaminação, é amplamente utilizado em testes médicos, avaliação de eficácia de medicamentos, pesquisa de expressão gênica, pesquisa transgênica, detecção de genes, detecção de patógenos, detecção de animais e plantas., testes de alimentos e outros campos.
Portanto, se você está envolvido em pesquisa básica em ciências da vida, ou funcionários de empresas farmacêuticas, empresas de criação de animais, empresas de alimentos ou mesmo funcionários de agências de inspeção e quarentena de entrada e saída, departamentos de monitoramento ambiental, hospitais e outras unidades, você estará mais ou menos exposto a ou precisa conhecer o conhecimento de dominar o PCR quantitativo.

Princípio de PCR em tempo real

PCR em tempo real é um método no qual substâncias fluorescentes são adicionadas ao sistema de reação de PCR, e a intensidade do sinal de fluorescência no processo de reação de PCR é monitorada em tempo real por um instrumento de PCR quantitativo e, finalmente, os dados experimentais são analisados ​​e processados.

【curva de amplificação】é a curva que descreve o processo dinâmico de PCR.A curva de amplificação da PCR não é na verdade uma curva exponencial padrão, mas sim uma curva sigmoide.

[Fase da plataforma da curva de amplificação]Com o aumento do número de ciclos de PCR, a inativação da DNA polimerase, o esgotamento de dNTPs e primers e a inibição da reação de síntese pelo subproduto da reação pirofosfato, etc., o PCR nem sempre se expande exponencialmente., e eventualmente entrará em um platô.

[Região de crescimento exponencial da curva de amplificação]Embora a fase de platô varie muito, em uma determinada região da região de crescimento exponencial da curva de amplificação, a repetibilidade é muito boa, o que é muito importante para a análise quantitativa da PCR.

[Valor limiar e valor Ct]Definimos o valor limite de detecção de fluorescência na posição apropriada na área de crescimento exponencial da curva de amplificação, ou seja, o valor limite (Threshold).A intersecção do valor do limiar com a curva de amplificação é o valor Ct, ou seja, o valor Ct refere-se ao número de ciclos (Threshold Cycle) quando o valor do limiar é atingido.

O gráfico abaixo mostra claramente a relação entre a linha limiar e a curva de amplificação, limiar e valor Ct.

【Como quantificar?】

Foi provado pela teoria matemática que o valor Ct tem uma relação linear inversa com o logaritmo do número de moldes iniciais.Real Time PCR monitora produtos de amplificação de PCR em tempo real e os quantifica durante a fase de amplificação exponencial.

Para cada ciclo de PCR, o DNA aumentou exponencialmente 2 vezes e logo atingiu um platô.

Assumindo que a quantidade de DNA inicial é A₀ , após n ciclos, a quantidade teórica de produto de DNA pode ser expressa como:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Então, quanto maior for a quantidade inicial de DNA A 0, mais cedo a quantidade do produto amplificado atinge o valor de detecção An , e o número de ciclos ao atingir An é o valor Ct.Isto é, quanto maior for a quantidade inicial de DNA A0, mais cedo os picos da curva de amplificação e correspondentemente menor é o número necessário de ciclos n.

Realizamos diluição gradiente do padrão de concentração conhecida e o utilizamos como molde para Real Time PCR, e uma série de curvas de amplificação serão obtidas em intervalos iguais na ordem de quantidade inicial de DNA de mais para menos.De acordo com a relação linear entre o valor Ct e o logaritmo do número de gabaritos iniciais, um[curva padrão] pode ser criada.

Substituindo o valor de Ct da amostra com concentração desconhecida na curva padrão, pode-se obter a quantidade padrão inicial da amostra com concentração desconhecida, que é o princípio quantitativo da PCR em tempo real.

Método de detecção de PCR em tempo real

A PCR em tempo real detecta produtos de amplificação de PCR detectando a intensidade de fluorescência no sistema de reação.

Princípio do método de incorporação de corante fluorescente】

corantes fluorescentes, como TB Green ® , podem se ligar de forma não específica ao DNA de fita dupla em sistemas de PCR e emitir fluorescência após a ligação.

A intensidade de fluorescência no sistema de reação aumentou exponencialmente com o aumento dos ciclos de PCR.Ao detectar a intensidade da fluorescência, a quantidade de amplificação do DNA no sistema de reação pode ser monitorada em tempo real e, em seguida, a quantidade do modelo inicial na amostra pode ser estimada inversamente.

【Princípio do método de sonda fluorescente】

sonda fluorescenteé uma sequência de ácido nucleico com um grupo fluorescente na extremidade 5' e um grupo de extinção na extremidade 3', que pode se ligar especificamente ao molde.Quando a sonda está intacta, a fluorescência emitida pelo fluoróforo é extinta pelo grupo de extinção e não pode fluorescer.Quando a sonda é decomposta, a substância fluorescente se dissocia e emite fluorescência.

Uma sonda fluorescente é adicionada à solução de reação de PCR.Durante o processo de recozimento, a sonda fluorescente se ligará à posição específica do molde.Durante o processo de extensão, a atividade exonuclease 5'→3' da enzima PCR pode decompor a sonda fluorescente hibridizada com o molde, e a substância fluorescente é dissociada para emitir fluorescência.Ao detectar a intensidade de fluorescência da sonda no sistema de reação, o objetivo de monitorar a quantidade de amplificação do produto de PCR pode ser alcançado.

【Seleção do método de detecção de fluorescência】

Se for usado para distinguir sequências com alta homologia e realizar detecção de PCR multiplex, como análise de tipagem SNP, o método de sonda fluorescente é insubstituível.
Para outros experimentos de PCR em tempo real, um método de quimera fluorescente simples, fácil e de baixo custo pode ser usado.

sondasEspecificidade forte, capaz de PCR multiplex

Deficiência

Requisitos de alta especificidade para amplificação;

PCR multiplex não pode ser realizadoNecessidade de design de sondas específicas, alto custo;

às vezes, o design da sonda é difícil

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