O valor de Ct é a forma de apresentação de resultado mais importante da PCR quantitativa fluorescente.É usado para calcular diferenças de expressão gênica ou número de cópias gênicas.Então, qual é o valor de Ct da quantificação de fluorescência considerado razoável?Como garantir a faixa efetiva do valor Ct?
O que é valor Ct?
Durante o processo de amplificação qPCR, o número correspondente de ciclos de amplificação (Cycle Threshold) quando o sinal de fluorescência do produto amplificado atinge o limite de fluorescência definido.C significa Ciclo e T significa Limiar.Simplificando, o valor Ct é o número de ciclos correspondentes a quando a amplificação inicial do modelo atinge uma certa quantidade de produto em qPCR.O chamado “uma certa quantidade de produto” será explicado mais adiante.
O que o valor Ct faz?
1. Relação entre amplificação exponencial, quantidade de modelo e valor de Ct
Idealmente, os genes em qPCR são acumulados por amplificação exponencial após um certo número de ciclos.A relação entre o número de ciclos de amplificação e a quantidade de produtos é: Quantidade de produto amplificado = quantidade de modelo inicial × (1+En) número de ciclos.No entanto, a reação qPCR nem sempre está em uma situação ideal.Quando a quantidade de produto amplificado atinge uma “determinada quantidade de produto”, o número de ciclos neste momento é o valor Ct, e está no período de amplificação exponencial.A relação entre o valor Ct e a quantidade de modelo inicial: Existe uma relação linear entre o valor Ct do modelo e o logaritmo do número de cópias iniciais do modelo.Quanto maior a concentração inicial do molde, menor o valor de Ct;quanto menor a concentração inicial do molde, maior o valor de Ct.
2. Curva de amplificação, limite de fluorescência e certa quantidade de produto de PCR
A quantidade de produto de amplificação qPCR é apresentada diretamente na forma de sinal fluorescente, ou seja, a curva de amplificação.No estágio inicial da PCR, a amplificação está em condições ideais, o número de ciclos é pequeno, o acúmulo de produto é pequeno e o nível de fluorescência não pode ser claramente distinguido do fundo de fluorescência.Depois disso, a fluorescência aumenta e entra na fase exponencial.A quantidade de produto de PCR pode ser detectada em um determinado ponto quando a reação de PCR está apenas na fase exponencial, que pode ser usada como “uma certa quantidade de produto”, e o conteúdo inicial do molde pode ser deduzido disso.Portanto, a intensidade do sinal de fluorescência correspondente a uma certa quantidade de produto é o limiar de fluorescência.
Na fase tardia da PCR, a curva de amplificação deixa de apresentar amplificação exponencial e entra na fase linear e na fase de platô.
3. Reprodutibilidade dos valores de Ct
Quando o ciclo de PCR atinge o número do ciclo do valor Ct, ele acaba de entrar no verdadeiro período de amplificação exponencial.Neste momento, o pequeno erro não foi amplificado, então a reprodutibilidade do valor de Ct é excelente, ou seja, o mesmo gabarito é amplificado em tempos diferentes ou em tubos diferentes ao mesmo tempo.Amplificação, o valor Ct obtido é constante.
1. Eficiência de amplificação En
A eficiência de amplificação por PCR refere-se à eficiência com que a polimerase converte o gene a ser amplificado em um amplicon.A eficiência de amplificação quando uma molécula de DNA é transformada em duas moléculas de DNA é de 100%.A eficiência de amplificação é comumente expressa como En.A fim de facilitar a análise dos artigos subseqüentes, os fatores que afetam a eficiência da amplificação são apresentados brevemente.
| Fatores de influência | explicação | Como julgar? |
| A. Inibidores de PCR | 1. O DNA modelo contém substâncias que inibem a reação de PCR, como proteínas ou detergentes.2. O cDNA após a transcrição reversa contém uma alta concentração de RNA molde ou componentes reagentes RT, que também podem inibir a reação de PCR subsequente. | 1. Se há poluição pode ser julgado medindo a proporção de A260/A280 e A260/A230 ou eletroforese de RNA.2. Se o cDNA é diluído de acordo com uma certa proporção após a transcrição reversa. |
| B. Projeto de primer impróprio | Primers não recozem de forma eficiente | Verifique os primers quanto a dímeros ou grampos de cabelo, incompatibilidades e, às vezes, designs intrônicos abrangentes. |
| C. Projeto inadequado do programa de reação de PCR | 1. Primers não podem recozir efetivamente2. Liberação insuficiente de DNA polimerase 3. A atividade da polimerase de DNA de alta temperatura a longo prazo diminuiu | 1. A temperatura de recozimento é maior que o valor TM do primer2. O tempo de pré-desnaturação é muito curto 3. O tempo de cada etapa do procedimento de reação é muito longo |
| D. Mistura insuficiente de reagentes ou erros de pipetagem | No sistema de reação, a concentração local dos componentes da reação de PCR é muito alta ou desigual, resultando em amplificação não exponencial da amplificação de PCR | |
| E. Comprimento do Amplicon | O comprimento do amplicon é muito longo, excedendo 300bp, e a eficiência da amplificação é baixa | Verifique se o comprimento do amplicon está entre 80-300bp |
| F. Influência dos reagentes qPCR | A concentração de DNA polimerase no reagente é baixa ou a concentração de íons no tampão não é otimizada, fazendo com que a atividade da enzima Taq não atinja o máximo | Determinação da eficiência de amplificação por curva padrão |
2. Faixa de valores de Ct
Os valores de Ct variam de 15-35.Se o valor Ct for inferior a 15, considera-se que a amplificação está dentro do intervalo do período de linha de base e o limiar de fluorescência não foi atingido.Idealmente, existe uma relação linear entre o valor de Ct e o logaritmo do número de cópias inicial do template, ou seja, a curva padrão.Pela curva padrão, quando a eficiência de amplificação é de 100%, o valor de Ct calculado para quantificar o número de cópias únicas do gene fica em torno de 35. Se for maior que 35, o número de cópias iniciais do template é teoricamente menor que 1, o que pode ser considerado sem sentido.
Para diferentes faixas de Ct do gene, devido à diferença no número de cópias do gene e eficiência de amplificação na quantidade inicial do molde, é necessário fazer uma curva padrão para o gene e calcular a faixa de detecção linear do gene.
3. Fatores de influência do valor Ct
A partir da relação entre o número de ciclos de amplificação e a quantidade de produto: quantidade de produto amplificado = quantidade de molde inicial × (1+En) número do ciclo, pode-se observar que, em condições ideais, a quantidade de molde inicial e En terá um impacto negativo no valor de Ct afetado.A diferença na qualidade do modelo ou eficiência de amplificação fará com que o valor Ct seja muito grande ou muito pequeno.
4. O valor de Ct é muito grande ou muito pequeno
Horário de postagem: 22 de fevereiro de 2023
