A perda auditiva (PA) é a doença de deficiência sensorial mais comum em humanos.Nos países desenvolvidos, cerca de 80% dos casos de surdez pré-lingual em crianças são causados ​​por fatores genéticos.Os mais comuns são defeitos de um único gene (como mostrado na Fig. 1), 124 mutações genéticas foram associadas à perda auditiva não sindrômica em humanos, o restante é causado por fatores ambientais.Um implante coclear (um dispositivo eletrônico colocado no ouvido interno que fornece estimulação elétrica diretamente ao nervo auditivo) é de longe a opção mais eficaz para tratar PA grave, enquanto um aparelho auditivo (um dispositivo eletrônico externo que converte e amplifica ondas sonoras) pode ajudar pacientes com PA moderada.No entanto, atualmente não há medicamentos disponíveis para tratar o LH hereditário (GHL).Nos últimos anos, a terapia gênica tem recebido atenção crescente como uma abordagem promissora para tratar a disfunção da orelha interna.

Figura 1.Distribuição do tipo de variação associada à surdez.[1]

Recentemente, cientistas do Instituto Salk e da Universidade de Sheffield publicaram um resultado de pesquisa em Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], que mostrou amplas perspectivas de aplicação para terapia gênica in vivo de surdez hereditária.Uri Manor, professor assistente de pesquisa no Salk Institute e diretor do Waitt Center for Advanced Biophotonics, disse que nasceu com perda auditiva severa e sentiu que restaurar a audição seria um presente maravilhoso.Sua pesquisa anterior descobriu que Eps8 é uma proteína reguladora de actina com atividades de ligação e capping de actina;nas células ciliadas da cóclea, o complexo proteico formado por Eps8 com MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 e GNAI3 existe principalmente nas pontas dos estereocílios longos, que juntamente com MYO15A localizam BAIAP2L2 nas pontas dos estereocílios mais curtos, são necessários para a manutenção dos feixes pilosos.Portanto, o Eps8 pode regular o comprimento dos estereocílios das células ciliadas, o que é essencial para a função auditiva normal;A exclusão ou mutação do Eps8 levará a estereocílios curtos, o que o torna incapaz de converter adequadamente o som em sinais elétricos para a percepção do cérebro, o que, por sua vez, leva à surdez..Ao mesmo tempo, o colaborador Walter Marcotti, professor da Universidade de Sheffield, descobriu que as células ciliadas não podem se desenvolver normalmente na ausência de Eps8.Neste estudo, Manor e Marcotti se uniram para investigar se a adição de Eps8 às células estereociliares poderia restaurar sua função e, por sua vez, melhorar a audição em camundongos.A equipe de pesquisa usou o vetor de vírus adeno-associado (AAV) Anc80L65 para fornecer a sequência de codificação contendo EPS8 de tipo selvagem na cóclea de camundongos P1-P2 recém-nascidos Eps8-/- por injeção de membrana de janela redonda;em células ciliadas da cóclea de camundongos A função dos estereocílios foi reparada antes de amadurecerem;e o efeito de reparo foi caracterizado por tecnologia de imagem e medição de estereocílios.Os resultados mostraram que o Eps8 aumentou o comprimento dos estereocílios e restaurou a função das células ciliadas em células de baixa frequência.Eles também descobriram que, com o tempo, as células pareciam perder a capacidade de serem resgatadas por essa terapia genética.A implicação é que este tratamento pode precisar ser administrado no útero, já que as células ciliadas Eps8-/- podem ter amadurecido ou acumulado danos além do reparo após o nascimento dos camundongos.“Eps8 é uma proteína com muitas funções diferentes e ainda há muito a explorar”, disse Manor.Pesquisas futuras incluirão a investigação do efeito da terapia genética Eps8 na restauração da audição em diferentes estágios de desenvolvimento e se é possível prolongar as oportunidades de tratamento.Coincidentemente, em novembro de 2020, o professor KarenB Avraham, da Universidade de Tel Aviv, em Israel, publicou seus resultados na revista EMBO Molecular Medicine [3], usando uma tecnologia inovadora de terapia genética para criar um vírus adeno-associado sintético inofensivo AAV9-PHP.B, O defeito do gene nas células ciliadas de camundongos Syne4-/- foi reparado pela injeção de um vírus carregando a sequência de codificação de Syne4 no ouvido interno de camundongos, permitindo que ele entre nas células ciliadas e libere o material genético transportado, permitindo que amadureçam e funcionem normalmente (como na Fig. 2).

Figura 2.Representação esquemática da anatomia da orelha interna, com foco no órgão de Corti e na função celular da nesprin-4.

Pode-se observar que o uso da terapia gênica para atingir o objetivo de tratar doenças hereditárias no nível do gene, inserindo, removendo ou corrigindo quaisquer genes mutantes para tratamento (isto é, controlando as alterações genéticas na doença) tem um alto efeito clínico.perspectivas de aplicação.Os métodos atuais de terapia genética para surdez geneticamente deficiente podem ser divididos nas seguintes categorias:

substituição de gene

A substituição de genes é indiscutivelmente a forma mais “simples” de terapia genética, baseada na identificação e substituição de um gene defeituoso por uma cópia normal ou selvagem do gene.Primeiro estudo bem-sucedido de terapia gênica da orelha interna para perda auditiva causada por deleção do gene do transportador vesicular de glutamato 3 (VGLUT3);A entrega mediada por AAV1 da superexpressão exógena de VGLUT3 em células ciliadas da orelha interna (IHCs) pode resultar em recuperação sustentada da audição, recuperação parcial da morfologia sináptica da fita e respostas convulsivas [4].No entanto, nos exemplos que incluem as duas substituições de genes entregues por AAV descritos na introdução acima, é importante observar que os modelos de camundongos usados ​​para certos tipos de distúrbios de perda auditiva hereditária por deleção de genes são temporalmente diferentes dos humanos e, em camundongos P1, o ouvido interno está no estágio maduro de desenvolvimento.Em contraste, os humanos nascem com um ouvido interno maduro.Esta diferença impede a possível aplicação dos resultados do camundongo no tratamento de distúrbios hereditários da surdez humana, a menos que a terapia genética seja administrada em orelhas de camundongos maduros.

Edição genética: CRISPR/Cas9

Comparado com a “substituição de genes”, o desenvolvimento da tecnologia de edição de genes trouxe o surgimento do tratamento de doenças genéticas desde a raiz.É importante ressaltar que o método de edição de genes compensa as deficiências dos métodos tradicionais de terapia genética de superexpressão que não são adequados para doenças de surdez hereditária dominante e o problema de que o método de superexpressão não dura muito.Depois que os pesquisadores chineses eliminaram especificamente o alelo mutante Myo6C442Y em camundongos Myo6WT/C442Y usando o sistema de edição de genes AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, e dentro de 5 meses após o nocaute, os camundongos A função auditiva do modelo foi restaurada;ao mesmo tempo, também foi observado que a taxa de sobrevivência das células ciliadas na orelha interna melhorou, a forma dos cílios tornou-se regular e os indicadores eletrofisiológicos foram corrigidos [5].Este é o primeiro estudo no mundo a usar a tecnologia CRISPR/Cas9 para o tratamento da surdez hereditária causada pela mutação do gene Myo6, e é um importante avanço da pesquisa da tecnologia de edição de genes para o tratamento da surdez hereditária.A tradução clínica do tratamento fornece uma base científica sólida.

Métodos de entrega de terapia genética

Para que a terapia gênica seja bem-sucedida, as moléculas de DNA nuas não podem penetrar nas células de forma eficaz devido à sua hidrofilicidade e carga negativa dos grupos fosfato, e para garantir a integridade das moléculas de ácido nucleico suplementadas, um método seguro e eficaz deve ser selecionado.O DNA suplementado é entregue à célula ou tecido alvo.O AAV é amplamente utilizado como veículo de entrega para o tratamento de doenças devido ao seu alto efeito infeccioso, baixa imunogenicidade e amplo tropismo para vários tipos de tecidos.Atualmente, um grande corpo de trabalho de pesquisa determinou o tropismo de diferentes subtipos de AAV em relação a diferentes tipos de células na cóclea de camundongos.O uso de características de entrega de AAV combinadas com promotores específicos de células pode alcançar a expressão específica de células, o que pode reduzir os efeitos fora do alvo.Além disso, como alternativa aos vetores AAV tradicionais, novos vetores AAV sintéticos estão sendo constantemente desenvolvidos e apresentam capacidade de transdução superior no ouvido interno, dos quais AAV2/Anc80L65 é o mais amplamente utilizado.Os métodos de distribuição não viral podem ser divididos em métodos físicos (microinjeção e eletroporação) e métodos químicos (nanopartículas de ouro, à base de lipídios e à base de polímero).Ambas as abordagens têm sido utilizadas no tratamento de distúrbios hereditários da surdez e têm mostrado diferentes vantagens e limitações.Além do veículo de entrega para terapia gênica como veículo, diferentes abordagens para administração de genes in vivo podem ser empregadas com base em diferentes tipos de células alvo, vias de administração e eficácia terapêutica.A intrincada estrutura do ouvido interno dificulta o alcance das células-alvo e a distribuição dos agentes de edição do genoma é lenta.O labirinto membranoso está localizado dentro do labirinto ósseo do osso temporal e inclui o ducto coclear, o ducto semicircular, o utrículo e o balão.Seu isolamento relativo, circulação linfática mínima e separação do sangue por uma barreira de labirinto de sangue limitam a administração sistêmica efetiva de terapêutica apenas a camundongos recém-nascidos.Para obter títulos virais adequados para terapia gênica, é necessária a injeção local direta de vetores virais no ouvido interno.As vias de injeção estabelecidas incluem [6]: (1) membrana da janela redonda (RWM), (2) traqueostomia, (3) cocleostomia endolinfática ou perilinfática, (4) membrana da janela redonda mais fenestração do tubo (CF) (como na Fig. 3).

Fig3.Entrega de orelha interna de terapia gênica.

Embora muitos avanços tenham sido feitos na terapia gênica, com base em objetivos translacionais clínicos, mais trabalho precisa ser feito antes que a terapia gênica possa se tornar uma opção de tratamento de primeira linha para pacientes com doenças genéticas, especialmente no desenvolvimento de vetores e métodos de entrega seguros e eficazes.Mas acreditamos que, em um futuro próximo, esses tipos de tratamentos se tornarão um elemento básico da terapia personalizada e terão um impacto extremamente positivo na vida das pessoas com doenças genéticas e de suas famílias.

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