A tecnologia de diagnóstico molecular utiliza métodos de biologia molecular para detectar a expressão e estrutura do material genético do corpo humano e vários patógenos, de modo a atingir o objetivo de prever e diagnosticar doenças.

Nos últimos anos, com a atualização e iteração da tecnologia de diagnóstico molecular, a aplicação clínica do diagnóstico molecular tornou-se cada vez mais extensa e profunda, e o mercado de diagnóstico molecular entrou em um período de rápido desenvolvimento.

O autor resume as tecnologias de diagnóstico molecular comuns no mercado e está dividido em três partes: a primeira parte apresenta a tecnologia de PCR, a segunda parte apresenta a tecnologia de amplificação isotérmica de ácido nucléico e a segunda parte apresenta a tecnologia de sequenciamento.

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Parte I: Tecnologia de PCR

tecnologia PCR

A PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma das tecnologias de amplificação de DNA in vitro, com uma história de mais de 30 anos.

A tecnologia PCR foi pioneira em 1983 por Kary Mullis de Cetus, EUA.Mullis solicitou uma patente de PCR em 1985 e publicou o primeiro artigo acadêmico sobre PCR no Science no mesmo ano.Mullis ganhou o Prêmio Nobel de Química em 1993.

Princípios Básicos da PCR

A PCR pode amplificar fragmentos de DNA alvo em mais de um milhão de vezes.O princípio é que, sob a catálise da DNA polimerase, o DNA da fita parental é usado como molde e um primer específico é usado como ponto de partida para a extensão.É replicado in vitro por meio de etapas como desnaturação, recozimento e extensão.O processo de DNA de fita filha complementar ao DNA modelo de fita pai.

O processo de PCR padrão é dividido em três etapas:

1. Desnaturação: Use alta temperatura para separar as fitas duplas de DNA.As pontes de hidrogênio entre as fitas duplas do DNA são quebradas em altas temperaturas (93-98°C).

2. Recozimento: Depois que o DNA de fita dupla é separado, a temperatura é reduzida para que o primer possa se ligar ao DNA de fita simples.

3. Extensão: A DNA polimerase começa a sintetizar fitas complementares ao longo das fitas de DNA a partir dos primers ligados quando a temperatura é reduzida.Quando a extensão é concluída, um ciclo é concluído e o número de fragmentos de DNA dobra.

Alternando essas três etapas 25 a 35 vezes, o número de fragmentos de DNA aumentará exponencialmente.

A engenhosidade da PCR é que diferentes iniciadores podem ser projetados para diferentes genes-alvo, de modo que os fragmentos do gene-alvo possam ser amplificados em um curto período de tempo.

Até agora, a PCR pode ser dividida em três categorias: PCR comum, PCR quantitativo fluorescente e PCR digital.

A primeira geração de PCR comum

Use um instrumento de amplificação de PCR comum para amplificar o gene alvo e, em seguida, use a eletroforese em gel de agarose para detectar o produto, apenas a análise qualitativa pode ser feita.

As principais desvantagens do PCR de primeira geração:

-Propenso a amplificação inespecífica e resultados falsos positivos.

-A detecção leva muito tempo e a operação é complicada.

-Apenas testes qualitativos podem ser feitos.

PCR quantitativo de fluorescência de segunda geração

O PCR quantitativo de fluorescência (PCR em tempo real), também conhecido como qPCR, é usado para monitorar o acúmulo de produtos amplificados por meio do acúmulo de sinais fluorescentes, adicionando sondas fluorescentes que podem indicar o progresso do sistema de reação e julgar os resultados através da curva de fluorescência, e pode ser quantificado com a ajuda do valor Cq e da curva padrão.

Como a tecnologia qPCR é realizada em sistema fechado, a probabilidade de contaminação é reduzida e o sinal de fluorescência pode ser monitorado para detecção quantitativa, por isso é a mais utilizada na prática clínica e tornou-se a tecnologia dominante em PCR.

As substâncias fluorescentes usadas na PCR quantitativa fluorescente em tempo real podem ser divididas em: sondas fluorescentes TaqMan, sinalizadores moleculares e corantes fluorescentes.

1) Sonda fluorescente TaqMan:

Durante a amplificação por PCR, uma sonda fluorescente específica é adicionada ao adicionar um par de primers.A sonda é um oligonucleotídeo e as duas extremidades são marcadas respectivamente com um grupo fluorescente repórter e um grupo fluorescente extintor.

Quando a sonda está intacta, o sinal fluorescente emitido pelo grupo repórter é absorvido pelo grupo quenching;durante a amplificação por PCR, a atividade da exonuclease 5'-3' da enzima Taq cliva e degrada a sonda, tornando o grupo fluorescente repórter e extintor O grupo fluorescente é separado, para que o sistema de monitoramento de fluorescência possa receber o sinal de fluorescência, ou seja, toda vez que uma fita de DNA é amplificada, uma molécula fluorescente é formada e o acúmulo do sinal de fluorescência é completamente sincronizado com a formação do produto de PCR.

2) Corantes fluorescentes SYBR:

No sistema de reação de PCR, um excesso de corante fluorescente SYBR é adicionado.Depois que o corante fluorescente SYBR é incorporado não especificamente na fita dupla do DNA, ele emite um sinal fluorescente.A molécula de corante SYBR que não for incorporada à cadeia não emitirá nenhum sinal fluorescente, garantindo assim o sinal fluorescente. O aumento dos produtos de PCR é completamente sincronizado com o aumento dos produtos de PCR.O SYBR se liga apenas ao DNA de fita dupla, portanto, a curva de fusão pode ser usada para determinar se a reação de PCR é específica.

3) Faróis moleculares

É uma sonda oligonucleotídica duplamente marcada com haste-alça que forma uma estrutura em grampo de cerca de 8 bases nas extremidades 5 e 3.As sequências de ácidos nucléicos em ambas as extremidades são emparelhadas complementarmente, fazendo com que o grupo fluorescente e o grupo de extinção sejam rígidos.Perto, não produzirá fluorescência.

Depois que o produto de PCR é gerado, durante o processo de recozimento, a parte do meio do farol molecular é emparelhada com uma sequência de DNA específica e o gene fluorescente é separado do gene supressor para produzir fluorescência.

As principais desvantagens do PCR de segunda geração:

Ainda falta sensibilidade e a detecção de espécimes de baixa cópia não é precisa.

Há influência do valor de fundo e o resultado é suscetível a interferência.

PCR digital de terceira geração

A PCR digital (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcula o número de cópias da sequência alvo por meio da detecção de ponto final e pode realizar detecção quantitativa absoluta precisa sem usar controles internos e curvas padrão.

A PCR digital usa detecção de ponto final e não depende do valor Ct (limiar do ciclo), portanto a reação da PCR digital é menos afetada pela eficiência da amplificação e a tolerância aos inibidores da reação da PCR é aprimorada, com alta precisão e reprodutibilidade.

Devido às características de alta sensibilidade e alta precisão, não é facilmente interferido por inibidores de reação de PCR e pode alcançar a verdadeira quantificação absoluta sem produtos padrão, que se tornou um hotspot de pesquisa e aplicação.

De acordo com as diferentes formas da unidade de reação, ela pode ser dividida em três tipos: sistemas microfluídicos, chip e gotículas.