PCR quantitativo de fluorescência (também conhecido como TaqMan PCR, doravante referido como FQ-PCR) é uma nova tecnologia quantitativa de ácido nucleico desenvolvida por PE (Perkin Elmer) nos Estados Unidos em 1995. Esta tecnologia é baseada em PCR convencional adicionando sondas fluorescentes marcadas.Comparado com o PCR flexível, o FQ-PCR tem muitas vantagens para realizar sua função quantitativa.Este artigo pretende descrever brevemente as características, princípios, métodos e aplicações da tecnologia.
1 Características
O FQ-PCR não só tem a alta sensibilidade do PCR comum, mas também devido à aplicação de sondas fluorescentes, pode detectar diretamente a mudança do sinal fluorescente durante a amplificação do PCR através do sistema de condução fotoelétrica para obter resultados quantitativos, o que supera muitas deficiências do PCR convencional, por isso também possui a alta especificidade da hibridização do DNA e a alta precisão da tecnologia de espectroscopia.
Por exemplo, produtos gerais de PCR precisam ser observados por eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio com luz ultravioleta ou por eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração com prata.Isso não apenas requer vários instrumentos, mas também leva tempo e esforço.As manchas usadas de brometo de etídio são prejudiciais ao corpo humano, e esses complicados procedimentos experimentais oferecem oportunidades para poluição e falsos positivos.No entanto, o FQ-PCR só precisa abrir a tampa uma vez durante o carregamento da amostra, e o processo subsequente é uma operação de tubo completamente fechado, que não requer pós-processamento de PCR, evitando muitos inconvenientes nas operações convencionais de PCR.O experimento geralmente usa o termociclador ABI7100 PCR desenvolvido pela empresa PE.
O instrumento tem as seguintes características: ① Ampla aplicação: pode ser usado para quantificação de produtos de PCR de DNA e RNA, pesquisa de expressão gênica, detecção de patógenos e otimização das condições de PCR.② Princípio quantitativo exclusivo: Usando sondas marcadas com fluorescência, a quantidade de fluorescência se acumulará com o ciclo de PCR após a excitação do laser, de modo a atingir o objetivo da quantificação.③ Alta eficiência de trabalho: Termociclador 9600 PCR integrado, controlado por computador de 1 a 2 horas para completar a amplificação e quantificação de 96 amostras automaticamente e de forma síncrona.④ Não há necessidade de eletroforese em gel: Não há necessidade de diluir e eletroforese da amostra, basta usar uma sonda especial para detectar diretamente no tubo de reação.⑤ Sem poluição na tubulação: O único tubo de reação totalmente fechado e o sistema de condução fotoelétrica são adotados, então não há necessidade de se preocupar com a poluição.⑥Os resultados são reproduzíveis: a faixa dinâmica quantitativa é de até cinco ordens de grandeza.Portanto, desde que essa tecnologia foi desenvolvida com sucesso, ela foi valorizada por muitos pesquisadores científicos e aplicada em muitos campos.
2 Princípios e métodos
O princípio de funcionamento do FQ-PCR é usar a atividade exonuclease 5'→3' da enzima Taq para adicionar uma sonda marcada com fluorescência ao sistema de reação de PCR.A sonda pode hibridizar especificamente com o molde de DNA contido na sequência do iniciador.A extremidade 5' da sonda é marcada com o gene de emissão de fluorescência FAM (6-carboxifluoresceína, pico de emissão de fluorescência em 518 nm) e a extremidade 3' é marcada com o grupo de extinção de fluorescência TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina, pico de emissão de fluorescência em 582 nm), o início 3' da sonda é fosforilado para evitar que a sonda seja estendida durante a amplificação por PCR.Quando a sonda permanece intacta, o grupo supressor suprime a emissão de fluorescência do grupo emissor.Uma vez que o grupo emissor é separado do grupo de extinção, a inibição é suspensa e a densidade óptica em 518 nm aumenta e é detectada pelo sistema de detecção de fluorescência.Quando a sonda é cortada, o efeito de extinção é liberado e o sinal fluorescente é liberado.Cada vez que o modelo é copiado, uma sonda é cortada, acompanhada pela liberação de um sinal fluorescente.Uma vez que existe uma relação de um para um entre o número de fluoróforos liberados e o número de produtos de PCR, esta técnica pode ser usada para quantificar com precisão o modelo.O instrumento experimental geralmente usa o termociclador ABI7100 PCR desenvolvido pela empresa PE, e outros termocicladores também podem ser usados.Se o sistema de reação do tipo ABI7700 for usado para o experimento, após a conclusão da reação, os resultados quantitativos podem ser fornecidos diretamente por meio de análise de computador.Se você usar outros termocicladores, precisará usar um detector de fluorescência para medir o sinal de fluorescência no tubo de reação ao mesmo tempo para calcular RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ representa a proporção da intensidade de luminescência do grupo de emissão fluorescente do tubo de amostra para a intensidade de luminescência do grupo de extinção, RQ- representa a proporção dos dois no tubo em branco, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) representa a quantidade de alteração do sinal de fluorescência durante a PCR Após o processamento dos dados, resultados quantitativos podem ser obtidos.Devido à introdução de sondas fluorescentes, a especificidade do experimento é significativamente melhorada.O design da sonda geralmente deve atender às seguintes condições: ①O comprimento da sonda deve ser de cerca de 20 a 40 bases para garantir a especificidade da ligação.②O conteúdo de bases GC está entre 40% e 60% para evitar a duplicação de sequências de nucleotídeos únicos.③ Evite hibridação ou sobreposição com primers.④ A estabilidade da ligação entre a sonda e o molde é maior que a estabilidade da ligação entre o primer e o molde, então o valor Tm da sonda deve ser pelo menos 5°C maior que o valor Tm do primer.Além disso, a concentração da sonda, a homologia entre a sonda e a sequência molde e a distância entre a sonda e o iniciador têm impacto nos resultados experimentais.
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Horário da postagem: 15 de outubro de 2021
