A característica marcante da reação de PCR é sua grande capacidade de amplificação e sensibilidade extremamente alta.A fim de melhorar o desempenho do PCR e a eficiência da detecção, estamos empenhados em melhorar a capacidade de amplificação do PCR e a sensibilidade de detecção, mas a dor de cabeça está no processo do experimento.Frequentemente ocorrem falsos positivos, e uma quantidade muito pequena de contaminação cruzada da amostra ou contaminação do produto de PCR pode causar falsos positivos no experimento.
Cinco tipos de contaminação de produtos de PCR
Existem muitas razões para a contaminação por PCR, que podem ser divididas nas seguintes categorias:
A contaminação do espécime é causada principalmente pela contaminação do recipiente para coleta do espécime, ou quando o espécime é colocado, vaza para fora do recipiente devido a vedação frouxa, ou o espécime está aderido à parte externa do recipiente, o que causa contaminação cruzada;A contaminação leva à contaminação entre espécimes;algumas amostras microbianas, especialmente vírus, podem se espalhar com aerossóis ou formar aerossóis, resultando em contaminação mútua.
A principal razão é que, durante a preparação dos reagentes de PCR, a pistola de amostra, o recipiente, a água bidestilada e outras soluções são contaminadas pelo modelo de ácido nucleico de PCR.
Em laboratórios de biologia molecular e alguns laboratórios que usam plasmídeos clonados como controles positivos, o problema de contaminação por plasmídeos clonados também é comum.Como o conteúdo do plasmídeo de clonagem em volume unitário é bastante alto, e mais ferramentas e reagentes são necessários no processo de purificação, é muito provável que o plasmídeo nas células vivas seja contaminado devido ao forte crescimento e capacidade de reprodução das células vivas.
A contaminação de produtos amplificados é o problema de contaminação mais comum em reações de PCR.Como a quantidade de cópias do produto de PCR é grande (geralmente 1013 cópias/ml), que é muito maior do que o limite do número de cópias de detecção de PCR, uma quantidade muito pequena de contaminação do produto de PCR pode causar falsos positivos.
A poluição por aerossol é a forma mais provável de contaminação dos produtos de PCR e também é a mais fácil de passar despercebida.É formado pelo atrito entre a superfície do líquido e o ar.Geralmente, a contaminação por aerossol pode ser formada quando a tampa é aberta, quando a amostra é aspirada ou mesmo quando o tubo de reação é agitado vigorosamente.Segundo cálculos, uma partícula de aerossol pode conter 48.000 cópias, portanto a poluição causada por ela é um problema que merece atenção especial.
Em particular, os laboratórios de testes costumam usar o mesmo par de primers para testar um determinado gene.Com o tempo, uma grande quantidade de contaminação de produtos de PCR ocorrerá no espaço do laboratório.Uma vez que tal contaminação ocorre, é difícil eliminá-la em pouco tempo.
Para os três primeiros tipos de poluição, podemos usar meios eficazes para evitar, mas a poluição causada por produtos de PCR é difícil de prevenir, especialmente na construção de laboratórios de PCR não padronizados.No processo de PCR, quando a ponta da pipeta suga e sopra o líquido e a tampa do tubo de PCR é aberta, forma-se um aerossol.As moléculas de DNA carregadas pelo aerossol (um aerossol pode carregar dezenas de milhares de DNA) são difíceis de eliminar porque flutuam no ar.Assim que a próxima rodada de experimentos de PCR for introduzida, falsos positivos ocorrerão inevitavelmente.
Conforme mostrado na figura abaixo, o controle negativo também amplificou a banda de interesse correspondente:
A primeira parte desta edição sobre poluição e prevenção de PCR é apresentada aqui.A próxima edição traz a segunda parte "Prevenção da contaminação de produtos de PCR", fique ligado!
Horário da postagem: 25 de julho de 2017
