Perguntas frequentes paraKit de isolamento de RNA total animal
A seguinte análise dos problemas que você pode encontrar emextração de tecido animal/célula de RNA will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.
O RNA não é extraído ou os rendimentos do RNA são baixos
Muitas vezes, há uma variedade de fatores que afetam a eficiência da recuperação, como: conteúdo de RNA da amostra de tecido, método de operação, volume de eluição, etc.
1. Banho de gelo ou centrifugação criogênica (4 °C) foi realizada durante a operação.
Recomendação: Operar em temperatura ambiente (15-25°C) durante todo o processo, não tomar banho de gelo e centrifugar em baixas temperaturas.
2. Preservação inadequada da amostra ou tempo excessivo de armazenamento da amostra.
Recomendação: Armazene as amostras a -80 °C ou congele em nitrogênio líquido e evite o uso repetido de congelamento e descongelamento;tente usar tecido fresco ou células cultivadas para extração de RNA.
3. Lise insuficiente da amostra.
Recomendação: Ao homogeneizar o tecido, certifique-se de que o tecido esteja suficientemente homogeneizado e que as células do tecido estejam suficientemente divididas para explicar a liberação de RNA.
4. O eluente não foi adicionado corretamente.
Recomendação: confirme se o ddH livre de RNase2O é adicionado gota a gota no meio da membrana da coluna de purificação.
5. O volume correto de etanol absoluto não foi adicionado ao Buffer RL2 ou Buffer RW2.
Recomendação: Siga as instruções, adicione o volume correto de etanol absoluto ao Buffer RL2 e Buffer RW2 e misture bem antes de usar o kit.
6. A dosagem da amostra de tecido não é apropriada.
Recomendação: Use 10-20 mg de tecido ou (1-5) × 106células por 500 μl de tampão RL1, pois o uso excessivo de tecido pode resultar na redução da extração de RNA.
7. Volume de eluição inadequado ou eluição incompleta.
Recomendação: O volume de eluição da coluna de purificação é de 50-200 μl;se o efeito de eluição não for satisfatório, recomenda-se estender o tempo de colocação à temperatura ambiente após adicionar ddH livre de RNase pré-aquecido2O, por exemplo, por 5-10 min.
8. A coluna de purificação contém resíduos de etanol após a lavagem com Buffer RW2.
Recomendação: Se houver resíduo de etanol após a lavagem do Buffer RW2, centrifugar o tubo vazio por 1min, o tempo para a operação de centrifugação do tubo vazio pode ser aumentado para 2min ou a coluna de purificação pode ser colocada em temperatura ambiente por 5 min para remover adequadamente o etanol residual.
O RNA purificado é degradado
A qualidade do RNA purificado está relacionada a fatores como preservação da amostra, contaminação por RNase, manipulação, etc.
1. As amostras de tecido não são mantidas no tempo.
Recomendação: Se amostras de tecido ou células não forem usadas em tempo hábil após a coleta, criopreservar imediatamente a -80 °C ou nitrogênio líquido.Para extrair o RNA, use uma amostra de tecido ou célula recém-colhida sempre que possível.
2. Congelamento-descongelamento repetido de amostras de tecido.
Recomendação: Ao armazenar as amostras de tecido, é melhor cortá-las em pequenos pedaços para preservação e remover uma das peças ao usá-las para evitar o congelamento-descongelamento repetido da amostra e a degradação do RNA.
3. A RNase é introduzida ou não usando luvas descartáveis, máscaras, etc. durante a operação.
Recomendação: os experimentos de extração de RNA são melhor realizados em salas separadas de manipulação de RNA e a mesa é limpa antes do experimento.
Use luvas e máscaras descartáveis durante o experimento para minimizar a degradação do RNA causada pela introdução de RNase.
4. Os reagentes são contaminados com RNase durante o uso.
Recomendação: Substitua por um novo kit de isolamento de RNA total animal para experimentos relacionados.
5. Os tubos, ponteiras, etc. da centrífuga usados na manipulação do RNA estão contaminados com RNase.
Recomendação: Confirme se os tubos de centrífuga, ponteiras, pipetas, etc. usados na extração de RNA são todos livres de RNase.
O RNA obtido purificado afeta os experimentos a jusante
RNA purificado pela coluna de purificação, se os íons de sal, o teor de proteína for muito grande afetará o experimento a jusante, como: transcrição reversa, Northern Blot et al.
1. O RNA eluído contém resíduos de íons salinos.
Recomendação: Confirmar se o volume correto de etanol foi adicionado ao Buffer RW2 e realizar 2 lavagens de coluna de purificação na velocidade centrífuga indicada para operação;se houver algum resíduo de íon de sal, deixe a coluna de purificação em Buffer RW2 por 5 min em temperatura ambiente e realize a centrifugação para maximizar a remoção da contaminação de sal.
2. Resíduo de etanol no RNA eluído.
Recomendação: Confirmar que após a lavagem do tampão RW2, realizar a operação de centrifugação do tubo vazio na velocidade de centrifugação indicada para a operação, aumentar o tempo da operação de centrifugação do tubo vazio para 2 min se ainda houver resíduo de etanol, ou deixá-lo em temperatura ambiente por 5 min após a centrifugação do tubo vazio para maximizar a remoção do resíduo de etanol.
Isolamento de tipos de amostras de ácido nucleico
Os kits de isolamento de RNA da Foregene podem obter isolamento/extração total de RNA das seguintes fontes de amostra: tecido animal, planta, células, vírus, sangue, etc.
Como devo guardar o kit
Armazenamento em temperatura ambiente por 24 meses.
Hora da postagem: Mar-01-2022
