RNase é uma palavra sensível que muitos estudantes que frequentemente conduzem experimentos de extração de RNA não querem ouvir.Totalmente armado, o RNA que foi finalmente extraído com os reagentes altamente tóxicos fenol e clorofórmio foi degradado.Eu não estou reconciliado!!!Hoje, vamos dar uma olhada na origem do famoso Rnase.

Ribonuclease (RNase), ou RNase, é uma nuclease que pode hidrolisar o RNA em pequenas moléculas.A RNase, como uma pequena molécula de proteína, é extraordinariamente estável .A esterilização a vapor convencional de alta temperatura e alta pressão e os inibidores de proteína não podem inativá-lo completamente.A estabilidade da RNase vem principalmente das pontes dissulfeto na estrutura.Por exemplo, a RNase comumente usada do pâncreas bovino tem apenas 124 aminoácidos, mas contém 4 pontes dissulfeto.A ligação de enxofre e a ligação dissulfeto conferem à RNase excelente estabilidade térmica.Além disso, a rnase tem um peso molecular relativamente pequeno e pode restaurar rapidamente sua conformação original em muitos casos.

Além de extremamente estável,RNases são onipresentes no laboratório .RNase é um mecanismo de defesa biológica.Para uma célula, o RNA exógeno costuma ser fatal.Comparado com o DNA exógeno, o RNA exógeno costuma ser mais perigoso.O RNA é transcrito e traduzido com alegria, então quase todos os organismos desenvolveram RNases para se defender contra a invasão de RNA exógeno.Portanto, as células bacterianas cultivadas em laboratório e você que extrai o RNA exalam o aroma da RNase.Os fluidos do corpo humano (saliva, lágrimas, etc.) contêm uma grande quantidade de RNase, portanto, não chore quando o RNA for degradado.Quanto mais você chora, pior a degradação do RNA!!A irmã Daiyu não é adequada para extração de RNA!

Além disso, sua pele delicada também contém muito RNase, e os marcadores, pipetas, portas de geladeira e maçanetas que foram tocadas pela pele também contêm RNase.

Com tanta divagação, vamos dar uma olhada em como lidar com RNases.

A primeira coisa que todos pensam ao remover o RNA éDEPC(pirocarbonato dietílico).DEPC desnatura principalmente a proteína por combinação com o anel imidazólico do grupo ativo RNase histidina, inibindo assim a atividade da enzima.O DEPC a 0,1% pode ter um melhor efeito de remoção no Rnase, mas precisamos prestar atenção que o DEPC é um conhecido carcinógeno, portanto, atenção especial deve ser dada ao usá-lo.

Para RNase, precisamos partir de dois aspectos,a primeira é inibir a atividade da RNase endógena

Os reagentes convencionais de extração de RNA, como o isotiocianato de guanidina e o DTT contidos no Trizol, podem abrir a ligação dissulfeto da RNase, mas ainda existem algumas RNases, especialmente em amostras de tecido, portanto, preste atenção à baixa temperatura.

1.Mergulhe imediatamente a amostra de tecido em nitrogênio líquido após retirá-la ou em uma solução comercial de preservação de RNA.

2.Depois de extrair o RNA da amostra celular, adicione-o à solução de lise e lise-o na caixa de gelo

3. É melhor usar nitrogênio líquido para moagem quando as amostras de tecido são homogeneizadas.Ao usar um homogeneizador elétrico sem nitrogênio líquido, preste atenção ao pré-resfriamento total do adaptador de homogeneizado.

A segunda é a DNase exógena

1.Esteja totalmente armado, use um jaleco, use uma máscara e certifique-se de usar um par de luvas novas (não seja tão econômico!! Deve-se notar que o Trizol é super corrosivo e também é muito forte através das luvas, então não pingue nas mãos).

2.Todas as ponteiras de pipetas, tubos EP, tubos PCR e outros equipamentos usados ​​devem ser tratados de-RNase.Pode ser embebido em 0,1% DEPC e depois pressurizado sob alta pressão.Preste atenção à operação em uma capela.Tiranos locais podem comprar diretamente consumíveis para remover enzimas.

PS: Deixe-me contar um método preguiçoso.Embora a alta temperatura e a alta pressão não possam remover completamente a RNase, ela removerá uma grande parte dela.2 vezes de alta temperatura e alta pressão tem um bom efeito, e a extração de RNA tem pouco efeito.

3.O álcool pode desnaturar proteínas,então a mesa de extração de RNA pode ser limpa com álcool 75% , e as luvas também podem ser borrifadas com álcool.

4.A solução final de dissolução de RNA e o tubo de centrifugação também devem ser tratados com de-RNase.A água DEPC é uma solução de dissolução de RNA comumente usada.Vamos falar sobre o método correto de preparo da água DEPC (lembre-se de reembalar o DEPC comercial ao comprá-lo)

Adicione DEPC à água ultrapura a 1:1000, agite bem, deixe repousar durante a noite a 37°C e esterilize a 121°C sob alta temperatura e alta pressão por 15 minutos.A água DEPC pode ser armazenada a -20°C em alíquotas de 1 ml.

Finalmente, para resumir: baixa temperatura é a chave, consumíveis são bem manuseados, totalmente armados e menos conversa!

Bem, é isso para a estratégia de hoje.Desejo a você toda a concentração e pureza de RNA que você mencionou.Ambos A260/A280 são 2.0!!!

Claro, se você usar umkit de extração de RNA para operação em temperatura ambiente, você pode não encontrar os problemas acima.

A operação em temperatura ambiente, sem adição de DNase, extrai o RNA total das células em 11 minutos e extrai o RNA total de tecidos animais ou vegetais em 30 minutos.

Para amostras de teste, entre em contato:overseas@foregene.com

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