A PCR direta é uma reação que usa diretamente tecidos animais ou vegetais para amplificação sem extração de ácido nucléico.De muitas maneiras, o PCR direto funciona como o PCR regular

A principal diferença é o tampão personalizado usado na PCR direta, a amostra pode ser submetida diretamente à reação de PCR sem extração de ácido nucleico, mas existem requisitos correspondentes para a tolerância das enzimas e a compatibilidade do tampão envolvido na reação de PCR direta.

Embora existam mais ou menos inibidores de PCR em amostras comuns, o PCR direto ainda pode alcançar uma amplificação confiável sob a ação de enzimas e tampões.A reação de PCR tradicional requer ácido nucleico de alta qualidade como modelo, o que pode inibir o progresso suave da reação de PCR se o modelo contiver proteínas e outras impurezas.A PCR direta é atualmente uma das tecnologias mais populares no campo do diagnóstico molecular.

01 Direct PCR foi originalmente usado para animais e plantas

A aplicação mais antiga da PCR direta é no campo de animais e plantas, como sangue, tecido e cabelo de rato, gato, galinha, coelho, ovelha, gado, etc., folhas e sementes de plantas, etc., usados ​​para estudar genotipagem, transgênico, detecção de plasmídeo, análise de nocaute de genes, identificação de fonte de DNA, identificação de espécies, análise de SNP e outros campos.

Esses campos têm algumas características comuns, ou seja, o conteúdo do gene alvo é relativamente alto e a extração do ácido nucleico é problemática, portanto, a PCR direta pode não apenas economizar tempo e ter um pequeno impacto nos resultados, mas também economizar custos.

A PCR direta usada para detecção de patógenos é uma questão dos últimos anos, alguns fabricantes de reagentes de PCR fizeram muitos esforços nessa direção ao fazer inovações.Especialmente nesta epidemia de COVID-19, muitos desses produtos de detecção apareceram no mercado, como o kit de detecção de ácido nucléico SARS-CoV-2 (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) pesquisado e desenvolvido pela Foregene, que usa a tecnologia RT PCR em tempo real (rRT-PCR) para detecção qualitativa de ácidos nucleicos SARS-CoV-2 em amostras de zaragatoas nasofaríngeas ou orofaríngeas humanas.

A Foregene é uma das empresas que utilizam a tecnologia Direct PCR, para a detecção de ORF1ab normal, N, E evariante linhagens de ácidos nucleicos em amostras de zaragatoas nasofaríngeas ou orofaríngeas humanas, como a linhagem SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Reino Unido), linhagem B.1.351 (ZA), linhagem B.1.617 (IND) e linhagem P.1 (BR).

02  Reagentes necessários para PCR direto

Lisado de Amostra

O lisado de amostra pode ser configurado por você ou adquirido.A diferença na composição de diferentes marcas de lisado fará com que a capacidade de lise seja diferente e, em seguida, o tempo de lise será ligeiramente diferente.Por exemplo, para a preparação de amostras de tecido animal, geralmente são recomendados 30 minutos ou lise durante a noite, e a solução de lise para vírus varia de 3 a 10 minutos.

mistura mestre de PCR

Recomenda-se o uso de DNA polimerase hot-start para aumentar a amplificação específica e aumentar a capacidade de amplificação.O núcleo da PCR direta é uma polimerase altamente tolerante.

Elimine ou iniba componentes na amostra que afetam a amplificação do DNA

Depois que a amostra for processada com o lisado, proteínas, lipídios e outros detritos celulares serão liberados, essas substâncias inibirão a reação de PCR.Portanto, a PCR direta requer a adição de remoções ou inibidores correspondentes para reduzir a influência desses fatores.

03  Uma coleção de cinco pontos de conhecimento de PCR direto

Primeiro, a tecnologia Direct PCR é uma tecnologia de PCR direta para várias amostras biológicas.Nessa condição técnica, não há necessidade de separar e extrair o ácido nucléico, usar diretamente a amostra de tecido como objeto e adicionar os primers do gene alvo para realizar a reação de PCR.

Em segundo lugar, a tecnologia de PCR direto não é apenas uma tecnologia tradicional de amplificação de modelo de DNA, mas também inclui PCR de transcrição reversa de modelo de RNA.

Em terceiro lugar, a tecnologia de PCR direta não apenas executa diretamente reações de PCR qualitativas de rotina em amostras de tecido, mas também inclui reações de qPCR em tempo real, o que requer que o sistema de reação tenha forte capacidade de interferência de fluorescência antifundo e a fluorescência endógena extingue a capacidade antagônica.

Em quarto lugar, as amostras visadas pela tecnologia de PCR direto precisam apenas da liberação de modelos de ácido nucleico e não removem proteínas, polissacarídeos, íons de sais etc. que interferem na reação de PCR.O que requer que a polimerase de ácido nucleico e a mistura de PCR no sistema de reação tenham excelente resistência e adaptabilidade para garantir a atividade enzimática e precisão de replicação em condições complexas.

Quinto, a amostra de tecido visada pela tecnologia Direct PCR sem qualquer tratamento de enriquecimento de ácido nucleico e a quantidade de molde é muito pequena, o que requer que o sistema de reação tenha sensibilidade extremamente alta e eficiência de amplificação.