Acredito que todos sempre encontrarão tais ou tais problemas ao fazer reações de PCR, mas a maioria deles pode ser classificada em dois problemas principais:

Muito pouca amplificação do molde do gene (amplificação);
Demasiada amplificação de gene não-alvo.
O uso de aditivos é uma das estratégias comuns para resolver esses problemas.Normalmente, o papel dos aditivos tem dois aspectos:
estrutura secundáriade genes (estrutura secundária);
Reduzir o priming não específico.
Hoje, o editor apresentará brevemente a você os aditivos comuns nas reações de PCR e suas funções.
Aditivos que reduzem a estrutura secundária
sulfóxido(DMSO)
amostras de genecom alto teor de GC.No entanto, o DMSO também reduz grandemente a atividade da Taq polimerase.Portanto, todos devem equilibrar a acessibilidade do modelo e a atividade da polimerase.O editor sugere que você pode tentar diferentes concentrações de DSMO, como de 2% a 10%, para encontrar a concentração adequada ao seu experimento.
Detergentes não iônicos
Detergentes não iônicos, como 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 ou NP-40, geralmente reduzem a estrutura secundária do DNA.Embora isso possa aumentar a amplificação do gene modelo, também causará problemas de amplificação não específica.Portanto, esses aditivos funcionam bem para reações de PCR de baixo rendimento sem detritos, mas não tão bem para reações de PRC relativamente impuras.Outro benefício dos detergentes não iônicos é a redução da contaminação por SDS.Normalmente, durante o processo de extração de DNA, o SDS será levado para a etapa de PCR, o que inibe bastante a atividade da polimerase.Portanto, adicionar 0,5% de Tween-20 ou Tween-40 à reação pode neutralizar os efeitos negativos do SDS.
betaína_
A betaína pode melhorar a amplificação do DNA reduzindo a formação da estrutura secundária e geralmente é uma adição “misteriosa” aos kits comerciais de PCR.Se quiser usar betaína, deve colocar betaína ou betaína mono-hidratada (Betaine ou Betaine mono-hydrate), mas não cloridrato de betaína (Betaine HCl), ajuste para uma concentração final de 1-1,7M.A betaína também pode ajudar a melhorar a especificidade porque elimina a dependência da composição do par de bases da fusão/desnaturação do DNA.
Aditivos para reduzir o priming não específico
Formamida
A formamida é um aditivo de PCR orgânico comumente usado.Ele pode se combinar com o sulco maior e o sulco menor no DNA, reduzindo assim a estabilidade da dupla hélice do DNA mestre e diminuindo a temperatura de fusão do DNA.A concentração de formamida usada em experimentos de PCR é geralmente de 1% a 5%.
Tetrametilcloreto de amônio( TMAC)
O cloreto de tetrametilamônio pode aumentar a especificidade da hibridização (especificidade da hibridização) e aumentar a temperatura de fusão do DNA.Assim, o TMAC pode remover o priming não específico e reduzir a ligação incorreta de DNA e RNA.Se você usarprimers degeneradosna reação de PCR, lembre-se de adicionar TMAC, que é comumente usado em uma concentração de 15-100mM.
Outros aditivos comuns
Além das duas categorias de aditivos mencionadas acima, existem muitos aditivos comuns nas reações de PCR, embora tenham funções diferentes, também são muito importantes.
íon de magnésio
O íon magnésio é um cofator indispensável (cofator) da polimerase, ou seja, sem o íon magnésio, a polimerase é inativa.No entanto, muitos íons de magnésio também podem afetar a eficiência da polimerase.A concentração de íons de magnésio em cada reação de PCR irá variar.Agentes quelantes (como EDTA ou citrato), a concentração de dNTPs e proteínas afetam a concentração de íons de magnésio.Portanto, se você tiver problemas com seu experimento de PCR, pode tentar alterar diferentes concentrações de íons de magnésio, por exemplo, de 1,0 a 4,0 mM, com um intervalo de 0,5 a 1 mM entre elas.
Vale a pena notar que vários ciclos de congelamento e descongelamento podem levar à estratificação da concentração da solução de cloreto de magnésio.Portanto, você deve dissolvê-lo completamente antes de cada uso e misturá-lo bem antes de usá-lo.
Albumina de soro bovino(Albumina bovina, BSA)
Em experimentos de química molecular, a albumina de soro bovino é um aditivo muito comum, especialmente em experimentos de digestão com enzimas de restrição e PCR.Nas reações de PCR, o BSA é útil na redução de contaminantes, como compostos fenólicos.E também é dito que pode reduzir a adesão dos reagentes à parede do tubo de ensaio.Na reação de PCR, geralmente a concentração de BSA adicionada pode chegar a 0,8 mg/ml.
 
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