Verificar o desempenho de primers e sondas no estágio inicial de reagentes de PCR e determinar as condições de reação mais adequadas são os pré-requisitos para garantir o bom andamento dos experimentos formais.
Então, como precisamos confirmar a sonda inicial no estágio inicial?
Os principais indicadores são linha de base, curva de amplificação, valor de ct, eficiência de amplificação, detecção de amostra de baixa concentração, CV, etc.
Linha de base
A linha de base é a linha horizontal na curva de amplificação de PCR.Nos primeiros ciclos da reação de amplificação por PCR, o sinal de fluorescência não muda muito e forma uma linha reta.Esta linha reta é a linha de base.
Ao rastrear sondas de primer de PCR, preste atenção se a linha de base está nivelada.A pureza da concentração da sonda de primer afetará a linha de base, como fazendo com que a linha de base suba ou caia.A linha de base também é um indicador muito intuitivo.
Curva de Amplificação
Outro indicador intuitivo é a forma da curva de amplificação.É melhor ter uma curva em forma de S para evitar amplificação secundária ou outras curvas de amplificação anormais.
Valor Ct
O número de ciclos correspondente ao ponto de inflexão desde a linha de base até o crescimento exponencial é o valor Ct.
Para a mesma amostra, diferentes sondas de primer resultam em diferentes curvas de amplificação, e o valor de Ct correspondente será afetado pela eficiência de amplificação e grau de interferência.Em teoria, quanto menor o valor de Ct da sonda iniciadora que escolhermos, melhor.
Eficiência de amplificação
Um dos métodos mais confiáveis e estáveis para avaliar a eficiência da amplificação por PCR é a curva padrão, que também é amplamente reconhecida pelos pesquisadores.O método envolve fazer uma série de amostras para controlar o número relativo de modelos de destino.Essas amostras são geralmente feitas por diluições seriadas de soluções-mãe concentradas, a mais comumente usada é a diluição de 10 vezes.Usando uma série de amostras diluídas, usando o programa qPCR padrão para amplificar para obter o valor Cq e, finalmente, desenhar uma curva padrão de acordo com a concentração de cada amostra e o valor Cq correspondente para obter a equação linear Cq= -klgX0+b e a eficiência de amplificação E=10(-1 /k)-1.Ao usar qPCR para análise quantitativa, a eficiência de amplificação deve estar na faixa de 90%-110% (3,6>k>3,1).
Detecção de Amostras de Baixa Concentração
Quando a concentração da amostra é baixa, as taxas de detecção de diferentes sondas de primer são diferentes.Selecionamos 20 amostras de baixa concentração para replicar, e o sistema primer-sonda com a maior taxa de detecção é o melhor.
Coeficiente de Variação (CV)
10 amostras duplicadas podem ser detectadas com diferentes sondas de primer de acordo com o padrão de linha do reagente para detecção de amplificação de ácido nucleico.
Reagentes Quantitativos:
Precisão
A precisão dentro de um lote deve atender: o coeficiente de variação (CV,%) do valor logarítmico da concentração de teste é ≤5%.Quando a concentração da amostra é baixa, o coeficiente de variação (CV,%) do logaritmo da concentração de detecção é ≤10%
Reagentes qualitativos:
Precisão
A precisão dentro de um lote deve atender:
(1) Coeficiente de variação do valor Ct (CV,%) ≤5%
A mesma amostra é testada em paralelo por 10 vezes e os resultados do teste devem ser consistentes
Horário da postagem: 18 de setembro de 2021
