Autores: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Unidade: Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang afiliado à Universidade Tongji

Atualmente, o principal tipo de amostra para detecção de ácidos nucleicos de patógenos respiratórios é o swab da garganta.Existem muitos tipos de soluções de preservação de amostras comumente usadas, todas as quais precisam ser refrigeradas ou congeladas para transporte e armazenamento;É difícil controlar todo o processo de baixa temperatura durante o processo de coleta e transporte, e é difícil garantir o controle de qualidade antes do teste da amostra^[1-2].

A RNase (RNase) é uma endonuclease que hidrolisa o RNA, principalmente rompendo as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos.A molécula de RNase é muito estável, existem pontes dissulfeto na estrutura e sua atividade não requer a presença de cátions bivalentes, portanto, a RNase não é facilmente desnaturada e é fácil renaturar mesmo após alta temperatura ou uso de desnaturantes.As RNases são divididas em endógenas e exógenas.As RNases endógenas podem ser liberadas ao mesmo tempo em que as células são rompidas.Portanto, eliminar o papel das RNases endógenas é uma etapa muito crítica no processo de extração de RNA.As RNases exógenas são amplamente distribuídas.RNases existem no ar, pele humana, cabelo e saliva, que são razões importantes para a fácil degradação do RNA^[3].

consulta de dados

A CANS-CL02-A009 “Aplicação das Diretrizes de Qualidade e Acreditação de Competências de Laboratórios Médicos no Campo do Diagnóstico Molecular” nos requisitos técnicos propõe que padrões apropriados de qualidade da água sejam formulados de acordo com a aplicação;Recipientes herméticos descartáveis:

RNase/Classificação

(1) RNase A

A ribonuclease A (RNase A), derivada do pâncreas bovino, é uma endoribonuclease que pode atacar especificamente a extremidade 3' de resíduos de pirimidina no RNA, cortando citosina ou uracila formada por nucleotídeos adjacentes.Ligação fosfodiéster, o produto final da reação é um nucleotídeo de pirimidina 3' e um oligonucleotídeo com um nucleotídeo de pirimidina 3' no final.

(2) RNase T1

A ribonuclease T1 (RNase T1) é derivada de Aspergillus orjzae, atua especificamente no fosfato 3'-terminal da guanina, e o sítio de clivagem é entre o fosfato 3' da guanina e a hidroxila 5' dos nucleotídeos adjacentes.O produto final da reação é o ácido 3'guanílico e fragmentos de oligonucleotídeos com ácido 3'guanílico no final.

(3) RNase H

A ribonuclease H (RNase H) foi descoberta pela primeira vez no tecido do timo de bezerro, e seu gene codificador foi clonado em Escherichia coli.Ele pode degradar especificamente DNA: fitas de RNA em duplexes híbridos de RNA, resultando em oligonucleotídeos e mononucleotídeos com extremidades 3'-OH e 5'-monofosfato, não pode degradar DNA ou RNA de fita simples ou dupla.

RNase

Função e uso

A ribonuclease pode catalisar a degradação do ácido ribonucleico (RNA) e pode ser sintetizada artificialmente.A pomada medicinal é usada topicamente para tratar traumas e dores nas articulações.De acordo com relatórios, a ribonuclease pode alterar o metabolismo da célula hospedeira, inibir a síntese do vírus, inibir a proliferação do vírus influenza in vitro e inibir a formação de vírus da vacínia e herpes em embriões de galinha.Uso clínico da injeção intramuscular diária de ribonuclease de 180 mg, benéfica para o tratamento da encefalite epidêmica, a ribonuclease pode catalisar a degradação do ácido ribonucleico (RNA) e agora pode ser sintetizada artificialmente.A pomada medicinal é usada topicamente para tratar traumas e dores nas articulações.De acordo com relatórios, a ribonuclease pode alterar o metabolismo da célula hospedeira, inibir a síntese do vírus, inibir a proliferação do vírus influenza in vitro e inibir a formação de vírus da vacínia e herpes em embriões de galinha.O uso clínico de injeção intramuscular diária de ribonuclease de 180 mg é benéfico para o tratamento da encefalite epidêmica.

RNase

Definição do Inibidor

Definição de unidade inibidora de RNase: A quantidade de enzima necessária para inibir 50% da atividade de 5ng RNase A é uma unidade.

Como funcionam os inibidores de RNase

Isotiocianato de guanidina:

Isotiocianato de guanidina é um composto orgânico com a fórmula molecular C2H6N4S.Usado principalmente em medicina biológica, reagentes químicos, etc. O isotiocianato de guanidina é um agente de lise de proteínas e é freqüentemente usado como o principal componente da solução de lise em reagentes de diagnóstico molecular.Pode lisar o tecido, destruir a estrutura celular e dissociar o ácido nucleico da nucleoproteína e tem forte desnaturação para RNase.É o inibidor de RNase mais eficaz atualmente.

TRIzol é um novo reagente de extração de RNA total que pode extrair diretamente o RNA total de células ou tecidos.Contém substâncias como fenol e isotiocianato de guanidina, que podem romper rapidamente as células e inibir as nucleases liberadas pelas células.

(No entanto, o isotiocianato de guanidina é perigoso para a saúde dos pesquisadores de laboratório.)

RNasina:

Glicoproteína ácida extraída de fígado de rato ou blastoderma humano.A Rnasina é um inibidor não competitivo da RNase, que pode se ligar a várias RNases para inativá-las.

(Mais detalhes: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Halta temperatura:

Alta temperatura também é um meio comum de desnaturação de proteínas.

Dietilpirocarbonato (DEPC):

O DEPC é um inibidor de RNase forte, mas incompleto, que pode inibir a atividade de RNase combinando-se com o anel de imidazol do aminoácido do grupo ativo de RNase para desnaturar proteínas.

Complexo Vanadil ribonucleosídeo:

Um complexo formado por íons de óxido de vanádio e nucleosídeos, que se liga à RNase na forma de substâncias de transição, que podem inibir quase completamente a atividade da RNase

outro:

SDS, ureia, terra de diatomáceas, etc. também têm um certo efeito inibitório na RNase.

Avaliações de especialistas

Li Yujie Técnico Chefe

Diretor do Departamento de Laboratório, Hospital Jiaozhou, Hospital Dongfang Afiliado à Universidade Tongji

A fim de evitar a biodegradação da RNase exógena, máscaras, luvas e gorros devem ser usados ​​e substituídos frequentemente durante o processo de extração de RNA.Toda vidraria deve ser assada em estufa de secagem a 200°C por mais de 2 horas.Materiais usados ​​para assar, como plástico, precisam ser tratados com água DEPC e depois lavados com água destilada.Os reagentes ou dispositivos utilizados para extração, preservação e identificação de RNA devem ser dedicados ao RNA, devendo ser criada uma área de operação de RNA independente.

referências:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bactérias e vírus na nasofaringe imediatamente antes do início de infecções respiratórias agudas em crianças indígenas australianas [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Divisão de Controle de Infecção Hospitalar da Associação Chinesa de Medicina Preventiva.Diretrizes para a coleta e inspeção de espécimes microbianos clínicos [J].Jornal Chinês de Infecção Hospitalar, 2018(20):3192-3200.

[3] “Teste Clínico Dez Mil Porquês Volume de Teste de Biologia Molecular”