No estágio inicial do surto, devido ao rápido desenvolvimento, o diagnóstico rápido de pacientes suspeitos é a chave para prevenir a COVID-19.Alguns reagentes de detecção de ácido nucleico aprovados têm um tempo de desenvolvimento curto e há problemas como confirmação de desempenho apressada, otimização insuficiente de reagentes e grandes diferenças entre lotes;Os problemas de vários laboratórios clínicos em vários aspectos do processo de detecção de ácidos nucleicos também podem afetar a precisão dos resultados da detecção de ácidos nucleicos.Este artigo se concentrará nos principais links e pontos na detecção atual de ácido nucleico do SARS-CoV-2 e analisará os problemas de reexame falso negativo e positivo da detecção laboratorial de ácido nucleico e inconsistência clínica.

Princípios da detecção de ácido nucleico SARS-CoV-2

O SARS-CoV-2 é um vírus de RNA com uma sequência genômica de cerca de 29 kb, com 10 genes, que podem codificar efetivamente 10 proteínas.Os vírus são compostos de RNA e proteínas, e a camada mais externa é um revestimento externo composto de lipídios e glicoproteínas.No interior, o capsídeo da proteína envolve o RNA nele, protegendo assim o RNA facilmente degradável (P1).

Estrutura P1 do SARS-COV-2

Os vírus invadem as células por meio de receptores específicos da superfície celular para causar infecção e usam células hospedeiras para se replicar.

O princípio da detecção de ácido nucleico viral é expor o RNA viral através de um lisado celular e, em seguida, usar a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa fluorescente em tempo real (RT-PCR) para detecção.

A chave para o princípio de detecção é usar primers e sondas para alcançar a “correspondência direcionada” de sequências de ácidos nucleicos, ou seja, encontrar a sequência de ácidos nucleicos do SARS-CoV-2 que é diferente de outros vírus em cerca de 30.000 bases (a semelhança do ácido nucleico com outros vírus) área “baixa”), projetar primers e sondas.

Os primers e sondas são altamente compatíveis com a região específica do ácido nucleico SARS-CoV-2, ou seja, a especificidade é muito forte.Uma vez que o resultado da amplificação RT-PCR fluorescente em tempo real da amostra a ser testada for positivo, isso prova que o SARS-CoV-2 está presente na amostra.Veja P2.

Etapas P2 da determinação do ácido nucleico SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente em tempo real)

Condições e requisitos de laboratório para detecção de ácido nucleico SARS-CoV-2

Os laboratórios de teste de ácido nucleico são os mais ideais para ambientes de pressão negativa e devem prestar atenção ao monitoramento da pressão, manter o fluxo de ar e eliminar os aerossóis.O pessoal de teste de ácido nucleico deve ter as qualificações correspondentes, receber treinamento relevante sobre reação em cadeia da polimerase e passar na avaliação.O laboratório deve ser estritamente gerenciado, zoneado no local e pessoal irrelevante é estritamente proibido de entrar.A área limpa deve ser ventilada e desinfetada no local.Itens relevantes são colocados em zonas, limpos e sujos são separados, substituídos a tempo e descontaminados no local.Desinfecção de rotina: Desinfetante à base de cloro é a principal solução para áreas maiores, e álcool 75% pode ser usado para áreas pequenas.Uma boa maneira de lidar com os aerossóis é abrir as janelas para ventilação, e a desinfecção do ar também pode ser realizada por meio de raios ultravioleta, filtração e desinfecção do ar.

Principais links e parâmetros da determinação do ácido nucleico do SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente em tempo real)

Embora os laboratórios geralmente prestem muita atenção à “detecção” de ácidos nucleicos, na verdade, a “extração” de ácidos nucleicos também é uma das etapas principais para uma detecção bem-sucedida, que está intimamente relacionada à coleta e armazenamento de amostras de vírus.

Atualmente, as amostras respiratórias mais utilizadas, como swabs nasofaríngeos, utilizam o segundo método, que é uma solução de inativação (preservação) preparada com base na extração de ácido nucleico e solução de lise.Por um lado, esta solução de preservação do vírus pode desnaturar a proteína do vírus, perder sua atividade e deixar de ser infeccioso, além de melhorar a segurança da etapa de transporte e detecção;por outro lado, pode quebrar diretamente o vírus para liberar o ácido nucleico, eliminar a enzima de decomposição do ácido nucleico e prevenir o vírus.O RNA é degradado.

Uma solução de amostragem de vírus preparada com base na solução de lise de extração de ácido nucleico.Os principais componentes são sais balanceados, agente quelante de ácido etilenodiaminotetracético, sal de guanidina (isotiocianato de guanidina, cloridrato de guanidina, etc.), surfactante aniônico (dodecano) sulfato de sódio), surfactante catiônico (oxalato de tetradecil trimetil amônio), fenol, 8-hidroxiquinolina, ditiotreitol, proteinase K e outros vários ou mais componentes.Atualmente, existem muitos tipos de kits de extração de ácidos nucleicos, e diferentes reagentes de extração e purificação de ácidos nucleicos são usados.Mesmo que seja usado o mesmo reagente de extração e purificação de ácidos nucleicos, os procedimentos de extração de cada kit são diferentes.

Atualmente, os produtos do kit de detecção de ácido nucleico aprovados pela Administração Nacional de Produtos Médicos são selecionados com base nos genes ORF1ab, E e N no genoma do SARS-CoV-2.Os princípios de detecção de diferentes produtos são basicamente os mesmos, mas seus primers e designs de sonda são diferentes.Existem segmentos de destino único (ORF1ab), segmentos de destino duplo (ORF1ab, N ou E) e segmentos de três destinos (ORF1ab, N e E).A diferença entre detecção e interpretação, extração de ácido nucleico e sistema de reação RT-PCR fluorescente em tempo real deve se referir às instruções relevantes do kit, e é recomendável que os usuários sigam rigorosamente o método de interpretação especificado nas instruções do kit para interpretação.As regiões comuns, primers e sequências de sondas amplificadas por RT-PCR fluorescente em tempo real são mostradas em P3.

P3 A localização do alvo do amplicon SARS-CoV-2 no genoma e a sequência de primers e sondas

Interpretação dos resultados da determinação do ácido nucleico SARS-CoV-2 (Rreal-TRT-PCR fluorescente ime)

“Plano de Prevenção e Controle de Pneumonia para Infecção por SARS-CoV-2 (Segunda Edição)” pela primeira vez esclareceu os critérios para julgar os resultados da amplificação de um único gene:

1. Nenhum Ct ou Ct≥40 é negativo;

2. Ct<37 é positivo;

3. O valor Ct de 37-40 é a área da escala de cinza.Recomenda-se repetir o experimento.Se o resultado de refazer Ct<40 e a curva de amplificação tiver picos óbvios, a amostra é considerada positiva, caso contrário, é negativa.”

A terceira edição do guia e a quarta edição do guia mantiveram os critérios acima.No entanto, devido aos diferentes alvos utilizados nos kits comerciais, a referida 3ª edição do guia não trouxe os critérios para determinação da combinação de alvos, enfatizando que devem prevalecer as instruções fornecidas pelo fabricante.A partir da quinta edição das diretrizes, duas metas foram esclarecidas, especialmente os critérios de julgamento de uma única meta difícil de julgar.Ou seja, se o laboratório quiser confirmar que um caso é positivo para detecção de ácido nucleico SARS-CoV-2, o seguinte deve ser atendido 1 de 2 condições:

(1) Dois alvos de SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) na mesma amostra são testados positivos por RT-PCR fluorescente em tempo real.Se um único alvo for positivo, uma nova amostragem e um novo teste são necessários.Se os resultados do teste forem Se o único alvo ainda for positivo, ele será considerado positivo.

(2) Duas amostras de RT-PCR fluorescente em tempo real mostraram um único alvo positivo ao mesmo tempo ou duas amostras do mesmo tipo mostraram um resultado de teste positivo de um único alvo, que pode ser considerado positivo.No entanto, as diretrizes também enfatizam que os resultados negativos do teste de ácido nucleico não podem excluir a infecção por SARS-CoV-2.Fatores que podem causar falsos negativos precisam ser excluídos, incluindo má qualidade da amostra (amostras respiratórias de orofaringe e outras partes), coleta de amostras muito cedo ou muito tarde, amostras não foram armazenadas, transportadas e processadas corretamente e a própria tecnologia apresentou problemas (variação de vírus, inibição de PCR), etc.

Causas de falsos negativos na detecção de SARS-CoV-2

O conceito de “falso negativo” nos testes de ácido nucleico atualmente em questão geralmente se refere a “falsos negativos” nos quais os resultados do teste de ácido nucleico são inconsistentes com as manifestações clínicas, ou seja, sintomas clínicos e resultados de imagem são altamente suspeitos de COVID-19, mas os testes de ácido nucleico são sempre “negativos” muitas vezes.O Centro de Laboratórios Clínicos da Comissão Nacional de Saúde explicou o teste “falso negativo” SARS-CoV-2.

(1) Existe uma certa quantidade de vírus nas células da pessoa infectada.Os dados existentes mostram que depois que o corpo é infectado pelo vírus, o vírus entra na garganta pelo nariz e boca, depois pela traqueia e brônquios, e então atinge os alvéolos.A pessoa infectada experimentará o período de incubação, sintomas leves e, em seguida, o processo de sintomas graves e diferentes estágios da doença.E a quantidade de vírus presente em diferentes partes do corpo é diferente.

Em termos de carga viral dos tipos de células, células epiteliais alveolares (trato respiratório inferior)> células epiteliais das vias aéreas (trato respiratório superior)> fibroblastos, células endoteliais e macrófagos, etc.;do tipo de amostra, líquido de lavagem alveolar (o mais excelente)>escarro de tosse profunda>swab nasofaríngeo>swab orofaríngeo>sangue.Além disso, o vírus também pode ser detectado nas fezes.No entanto, considerando a conveniência da operação e a aceitação dos pacientes, a ordem de amostra clínica comumente usada é swab orofaríngeo>swab nasofaríngeo>fluido de lavagem brônquica (operação complexa) e escarro profundo (geralmente tosse seca, difícil de obter) .

Portanto, a quantidade de vírus nas células da orofaringe ou nasofaringe de alguns pacientes é pequena ou extremamente baixa.Se apenas amostras da orofaringe ou nasofaringe forem coletadas para teste, o ácido nucleico viral não será detectado.

(2) Nenhuma célula contendo vírus foi coletada durante a coleta da amostra ou o ácido nucleico viral não foi preservado de forma eficaz.

[① Local de coleta inadequado, por exemplo, ao coletar zaragatoas orofaríngeas, a profundidade da coleta não é suficiente, as zaragatoas nasofaríngeas coletadas não são coletadas profundamente na cavidade nasal, etc. A maioria das células coletadas pode ser células livres de vírus;

②Swabs de amostragem são usados ​​incorretamente.Por exemplo, fibras sintéticas como fibra PE, fibra de poliéster e fibra de polipropileno são recomendadas para o material da cabeça do cotonete.Fibras naturais, como algodão, são usadas na operação real (forte absorção de proteína e difícil de lavar) E fibras de náilon (baixa absorção de água, levando a um volume de amostragem insuficiente);

③Uso incorreto de tubos de armazenamento de vírus, como uso indevido de tubos de armazenamento de plástico de polipropileno ou polietileno que são fáceis de absorver ácidos nucléicos (DNA/RNA), resultando em diminuição da concentração de ácido nucléico na solução de armazenamento.Na prática, recomenda-se o uso de plástico de polímero de polietileno-propileno e alguns recipientes de plástico de polipropileno especialmente tratados para armazenar ácidos nucleicos virais.]

[① Local de coleta inadequado, por exemplo, ao coletar zaragatoas orofaríngeas, a profundidade da coleta não é suficiente, as zaragatoas nasofaríngeas coletadas não são coletadas profundamente na cavidade nasal, etc. A maioria das células coletadas pode ser células livres de vírus;

②Swabs de amostragem são usados ​​incorretamente.Por exemplo, fibras sintéticas como fibra PE, fibra de poliéster e fibra de polipropileno são recomendadas para o material da cabeça do cotonete.Fibras naturais, como algodão, são usadas na operação real (forte absorção de proteína e difícil de lavar) E fibras de náilon (baixa absorção de água, levando a um volume de amostragem insuficiente);

③Uso incorreto de tubos de armazenamento de vírus, como uso indevido de tubos de armazenamento de plástico de polipropileno ou polietileno que são fáceis de absorver ácidos nucléicos (DNA/RNA), resultando em diminuição da concentração de ácido nucléico na solução de armazenamento.Na prática, recomenda-se o uso de plástico de polímero de polietileno-propileno e alguns recipientes de plástico de polipropileno especialmente tratados para armazenar ácidos nucleicos virais.]

(4) O funcionamento do laboratório clínico não é padronizado.As condições de transporte e armazenamento das amostras, a operação padronizada dos laboratórios clínicos, a interpretação dos resultados e o controle de qualidade são os principais fatores para garantir a precisão e a confiabilidade dos resultados dos testes.De acordo com os resultados da avaliação externa de qualidade realizada pelo Centro de Laboratórios Clínicos da Comissão Nacional de Saúde de 16 a 24 de março de 2020, dos 844 laboratórios que receberam resultados válidos, 701 (83,1%) foram qualificados e 143 (16,9%) não foram.Qualificado, as condições gerais de teste de laboratório são boas, mas diferentes laboratórios ainda têm diferenças na capacidade de operação do pessoal, capacidade de interpretação de amostra positiva de alvo único e controle de qualidade.

Como reduzir o falso negativo da detecção de ácido nucleico SARS-CoV-2?

A redução de falsos negativos na detecção de ácidos nucleicos deve ser otimizada a partir dos quatro aspectos da produção de falsos negativos.

(1) Existe uma certa quantidade de vírus nas células da pessoa infectada.A concentração do vírus em diferentes partes do corpo de pessoas suspeitas de infecção será diferente em momentos diferentes.Se não houver faringe, pode ser no lavado brônquico ou nas fezes.Se vários tipos de amostras puderem ser coletados ao mesmo tempo ou em diferentes estágios de progressão da doença para teste, ajudará a evitar falsos negativos.

(2) As células contendo vírus devem ser coletadas durante a coleta da amostra.Esse problema pode ser resolvido em grande parte com o fortalecimento do treinamento dos coletores de amostras.

(3) Reagentes IVD confiáveis.Ao realizar pesquisas sobre a avaliação do desempenho de detecção de reagentes em nível nacional e discutir os problemas existentes, a eficiência de detecção de reagentes pode ser melhorada e a sensibilidade da análise pode ser melhorada.

(4) Operação padronizada de laboratórios clínicos.Ao fortalecer o treinamento do pessoal do laboratório, melhorando continuamente o sistema de gestão da qualidade do laboratório, garantindo divisões razoáveis ​​e melhorando a capacidade do pessoal de detectar, é possível reduzir os falsos negativos devido a operações laboratoriais inadequadas.

Razões para o reteste positivo do teste de ácido nucleico SARS-CoV-2 em pacientes recuperados e com alta

O “Plano de diagnóstico e tratamento COVID-19 (Trial Seventh Edition)” estipula claramente que um dos critérios para pacientes com COVID-19 serem curados e receberem alta do hospital é que duas amostras consecutivas do trato respiratório tenham um teste de ácido nucleico negativo (pelo menos 24 horas de intervalo), mas há muito poucos O teste de ácido nucleico SARS-CoV-2 foi positivo novamente em pacientes com alta devido a vários motivos.

(1) O SARS-CoV-2 é um novo vírus.É necessário entender melhor seu mecanismo patogênico, o quadro completo da doença causada e as características do curso da doença.Portanto, por um lado, é necessário fortalecer o gerenciamento de pacientes com alta e realizar observação médica de 14 dias.Realizar acompanhamento, acompanhamento da saúde e orientação em saúde para aprofundar a compreensão de todo o processo de ocorrência, desenvolvimento e desfecho da doença.

(2) O paciente pode ser infectado com o vírus novamente.O acadêmico Zhong Nanshan disse: Como os pacientes curados têm anticorpos, o SARS-CoV-2 pode ser eliminado por anticorpos quando eles invadem novamente.São muitos os motivos, que podem ser a causa do paciente recuperado, ou pode estar relacionado com a mutação do vírus, ou mesmo a causa dos exames laboratoriais.Se for o próprio vírus, a mutação SARS-CoV-2 pode fazer com que o anticorpo produzido pelo paciente recuperado seja ineficaz contra o vírus mutante.Se o paciente for infectado com o vírus mutante novamente, o teste de ácido nucleico pode ser positivo novamente.

(3)No que diz respeito aos métodos de teste de laboratório, cada método de teste tem suas limitações.A detecção do ácido nucleico do SARS-CoV-2 deve-se à escolha da sequência do gene, à composição dos reagentes, à sensibilidade do método e a outras razões, fazendo com que os kits existentes tenham seus próprios limites de detecção mais baixos.Depois que o paciente é tratado, o vírus no corpo diminui.Quando a carga viral na amostra a ser testada estiver abaixo do limite inferior de detecção, aparecerá um resultado “negativo”.No entanto, esse resultado não significa que o vírus no corpo tenha desaparecido completamente.O vírus pode aparecer após a interrupção do tratamento.Ressurgimento”, continue a copiar.Portanto, recomenda-se a revisão uma vez por semana dentro de 2 a 4 semanas após a alta.

(4) O ácido nucléico é o material genético do vírus.O vírus é morto depois que o paciente foi submetido a tratamento antiviral, mas os fragmentos de RNA viral restantes ainda são retidos no corpo humano e não são completamente eliminados do corpo.Às vezes, em certas circunstâncias, pode ser mais retido.Muito tempo, e neste momento o teste de ácido nucleico será positivo “transitório”.Com a extensão do tempo de recuperação do paciente, depois que os fragmentos residuais de RNA no corpo são gradualmente esgotados, o resultado do teste de ácido nucleico pode se tornar negativo.

(5) O resultado do teste de ácido nucleico do SARS-CoV-2 apenas comprova a presença ou ausência de RNA viral, não podendo comprovar a atividade do vírus e se o vírus é transmissível.É necessário provar se um paciente que tem um teste de ácido nucléico positivo novamente se tornará uma fonte de infecção novamente.É necessário realizar cultura de vírus em amostras clínicas e cultivar um vírus “vivo” para provar que é infeccioso.

Resumo

Em resumo, os falsos negativos do teste de ácido nucleico SARS-CoV-2, os novos testes positivos e outras condições inconsistentes com as manifestações clínicas não podem ser completamente evitados.Na triagem e teste reais, recomenda-se combinar sintomas clínicos, exames de imagem (TC) e resultados de testes laboratoriais (teste de ácido nucleico + teste de anticorpo específico do vírus) para um diagnóstico abrangente para evitar diagnósticos perdidos e diagnósticos incorretos.Se os resultados do teste forem obviamente inconsistentes com as manifestações clínicas, recomenda-se realizar uma análise abrangente de todo o link do teste (coleta de amostras, circulação e links de processamento) para excluir possível infecção precoce pelo vírus SARS-CoV-2, infecção recorrente ou combinada com outras infecções por vírus respiratórios, etc.Se as condições permitirem, recomenda-se coletar amostras mais sensíveis, como escarro ou fluido de lavagem alveolar, para reexame.

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