• PCR é um método usado para amplificar DNA a partir de uma pequena quantidade de modelo de DNA.A RT-PCR utiliza transcrição reversa para produzir um modelo de DNA a partir de uma fonte de RNA que pode então ser amplificado.
• PCR e RT-PCR são normalmente reações de ponto final, enquanto qPCR e RT-qPCR usam a cinética da taxa de síntese do produto durante a reação de PCR para quantificar a quantidade de modelo presente.
• Métodos mais recentes, como a PCR digital, fornecem quantificação absoluta do modelo inicial de DNA, enquanto métodos como a PCR isotérmica reduzem a necessidade de equipamentos caros para fornecer resultados confiáveis.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular relativamente simples e amplamente utilizada para amplificar e detectar sequências de DNA e RNA.Em comparação com os métodos tradicionais de clonagem e amplificação de DNA, que muitas vezes podem levar dias, a PCR requer apenas algumas horas.A PCR é altamente sensível e requer um modelo mínimo para detecção e amplificação de sequências específicas.Os métodos básicos de PCR avançaram ainda mais a partir da simples detecção de DNA e RNA.Abaixo, fornecemos uma visão geral dos diferentes métodos de PCR e dos reagentes que fornecemos na Enzo Life Sciences para suas necessidades de pesquisa.Nosso objetivo é ajudar os cientistas a acessar rapidamente os reagentes de PCR para usar em seu próximo projeto de pesquisa!

PCR

Para PCR padrão, tudo que você precisa é de uma DNA polimerase, magnésio, nucleotídeos, primers, o modelo de DNA a ser amplificado e um termociclador.O mecanismo de PCR é tão simples quanto seu propósito: 1) o DNA de fita dupla (dsDNA) é desnaturado pelo calor, 2) os primers se alinham às fitas simples de DNA e 3) os primers são estendidos pela DNA polimerase, resultando em duas cópias do fita original de DNA.O processo de desnaturação, recozimento e alongamento ao longo de uma série de temperaturas e tempos é conhecido como um ciclo de amplificação (Fig. 1).

Cada etapa do ciclo deve ser otimizada para o modelo e conjunto de primers utilizados.Este ciclo é repetido aproximadamente 20-40 vezes, e o produto amplificado pode então ser analisado, normalmente por gel de agarose (Fig. 2).

Como a PCR é um método altamente sensível e são necessários volumes muito pequenos para reações únicas, recomenda-se a preparação de uma mistura mestre para diversas reações.A mistura principal deve ser bem misturada e depois dividida pelo número de reações, garantindo que cada reação conterá a mesma quantidade de enzima, dNTPs e primers.Muitos fornecedores, como a Enzo Life Sciences, também oferecem misturas de PCR que já contêm tudo, exceto os primers e o modelo de DNA.

Regiões ricas em guanina/citosina (ricas em GC) representam um desafio nas técnicas padrão de PCR.As sequências ricas em GC são mais estáveis ​​que as sequências com menor conteúdo de GC.Além disso, sequências ricas em GC tendem a formar estruturas secundárias, como alças em gancho.Como resultado, as cadeias duplas ricas em GC são difíceis de separar completamente durante a fase de desnaturação.Conseqüentemente, a DNA polimerase não consegue sintetizar a nova fita sem obstáculos.Uma temperatura de desnaturação mais alta pode melhorar isso, e ajustes para uma temperatura de recozimento mais alta e um tempo de recozimento mais curto podem impedir a ligação inespecífica de primers ricos em GC.Reagentes adicionais podem aumentar a amplificação de sequências ricas em GC.DMSO, glicerol e betaína ajudam a romper as estruturas secundárias causadas pelas interações de GC e, assim, facilitam a separação das fitas duplas.

PCR de início quente

A amplificação inespecífica é um problema que pode ocorrer durante a PCR.A maioria das DNA polimerases usadas para PCR funcionam melhor em temperaturas em torno de 68°C a 72°C.A enzima pode, no entanto, também ser activa a temperaturas mais baixas, embora num grau inferior.A temperaturas muito abaixo da temperatura de recozimento, os iniciadores podem ligar-se de forma não específica e conduzir a uma amplificação não específica, mesmo que a reação seja realizada em gelo.Isto pode ser evitado usando inibidores da polimerase que se dissociam da DNA polimerase apenas quando uma determinada temperatura é atingida, daí o termo PCR de início a quente.O inibidor pode ser um anticorpo que se liga à polimerase e desnatura à temperatura inicial de desnaturação (normalmente 95°C).

Polimerase de alta fidelidade

Embora as DNA polimerases amplifiquem com bastante precisão a sequência modelo original, podem ocorrer erros na correspondência de nucleotídeos.Incompatibilidades em aplicações como a clonagem podem resultar em transcrições truncadas e proteínas mal traduzidas ou inativas a jusante.Para evitar essas incompatibilidades, polimerases com atividade de “revisão” foram identificadas e incorporadas ao fluxo de trabalho.A primeira polimerase de revisão, Pfu, foi identificada em 1991 em Pyrococcus furiosus.Esta enzima Pfu tem atividade exonuclease de 3' a 5'.À medida que o DNA é amplificado, a exonuclease remove nucleotídeos incompatíveis na extremidade 3' da fita.O nucleotídeo correto é então substituído e a síntese de DNA continua.A identificação de sequências de nucleotídeos incorretas baseia-se na afinidade de ligação do nucleosídeo trifosfato correto com a enzima, onde a ligação ineficiente retarda a síntese e permite a substituição correta.A atividade de revisão da polimerase Pfu resulta em menos erros na sequência final em comparação com a DNA polimerase Taq.Nos últimos anos, outras enzimas de revisão foram identificadas e foram feitas modificações na enzima Pfu original para reduzir ainda mais a taxa de erro durante a amplificação do DNA.

RT-PCR

PCR de transcrição reversa, ou RT-PCR, permite o uso de RNA como modelo.Uma etapa adicional permite a detecção e amplificação de RNA.O RNA é transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA), usando transcriptase reversa.A qualidade e pureza do modelo de RNA são essenciais para o sucesso do RT-PCR.A primeira etapa do RT-PCR é a síntese de um híbrido DNA/RNA.A transcriptase reversa também possui uma função RNase H, que degrada a porção de RNA do híbrido.A molécula de DNA de fita simples é então completada pela atividade da DNA polimerase dependente de DNA da transcriptase reversa em cDNA.A eficiência da reação da primeira fita pode afetar o processo de amplificação.A partir daqui, o procedimento padrão de PCR é utilizado para amplificar o cDNA.A possibilidade de reverter o RNA em cDNA por RT-PCR tem muitas vantagens e é usada principalmente para análise de expressão gênica.O RNA é de fita simples e muito instável, o que torna difícil trabalhar com ele.Geralmente serve como uma primeira etapa no qPCR, que quantifica transcritos de RNA em uma amostra biológica.

qPCR e RT-qPCR

A PCR quantitativa (qPCR) é usada para detectar, caracterizar e quantificar ácidos nucleicos para inúmeras aplicações.Na RT-qPCR, os transcritos de RNA são frequentemente quantificados pela transcrição reversa primeiro em cDNA, conforme descrito acima, e então o qPCR é posteriormente realizado.Tal como na PCR padrão, o DNA é amplificado por três etapas repetidas: desnaturação, recozimento e alongamento.No entanto, no qPCR, a marcação fluorescente permite a coleta de dados à medida que a PCR avança.Esta técnica tem muitos benefícios devido à variedade de métodos e produtos químicos disponíveis.

No qPCR baseado em corante (tipicamente verde), a marcação fluorescente permite a quantificação das moléculas de DNA amplificadas, empregando o uso de um corante de ligação ao dsDNA.Durante cada ciclo, a fluorescência é medida.O sinal de fluorescência aumenta proporcionalmente à quantidade de DNA replicado.Assim, o DNA é quantificado em “tempo real” (Fig. 3).As desvantagens do qPCR baseado em corante são que apenas um alvo pode ser examinado por vez e que o corante se ligará a qualquer ds-DNA presente na amostra.

No qPCR baseado em sonda, muitos alvos podem ser detectados simultaneamente em cada amostra, mas isso requer otimização e design de sonda(s) específica(s) do alvo usadas além dos primers.Vários tipos de designs de sonda estão disponíveis, mas o tipo mais comum é uma sonda de hidrólise, que incorpora um fluoróforo e um supressor.A transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) evita a emissão do fluoróforo através do supressor enquanto a sonda está intacta.Contudo, durante a reacção de PCR, a sonda é hidrolisada durante a extensão do iniciador e a amplificação da sequência específica à qual está ligada.A clivagem da sonda separa o fluoróforo do supressor e resulta num aumento da fluorescência dependente da amplificação (Fig. 4).Assim, o sinal de fluorescência de uma reação qPCR baseada em sonda é proporcional à quantidade da sequência alvo da sonda presente na amostra.Como o qPCR baseado em sonda é mais específico do que o qPCR baseado em corante, muitas vezes é a tecnologia usada em ensaios de diagnóstico baseados em qPCR.

Amplificação Isotérmica

As técnicas de PCR mencionadas acima requerem equipamento de termociclagem caro para aumentar e diminuir com precisão as temperaturas da câmara para as etapas de desnaturação, recozimento e extensão.Foram desenvolvidas diversas técnicas que não necessitam de dispositivos tão precisos e podem ser realizadas em simples banho-maria ou mesmo dentro das células de interesse.Essas técnicas são chamadas coletivamente de amplificação isotérmica e funcionam com base na amplificação exponencial, linear ou em cascata.

O tipo mais conhecido de amplificação isotérmica é a amplificação isotérmica mediada por loop, ou LAMP.LAMP usa amplificação exponencial a 65⁰C para amplificar DNA ou RNA modelo.Ao realizar o LAMP, quatro a seis primers complementares às regiões do DNA alvo são usados ​​com uma DNA polimerase para sintetizar novo DNA.Dois desses primers possuem sequências complementares que reconhecem sequências nos outros primers e as ligam, permitindo a formação de uma estrutura em “alça” no DNA recém-sintetizado que auxilia no recozimento dos primers em rodadas subsequentes de amplificação.LAMP pode ser visualizado por vários métodos, incluindo fluorescência, eletroforese em gel de agarose ou colorimetria.A facilidade de visualização e detecção da presença ou ausência do produto por colorimetria e a falta de equipamentos caros necessários tornaram o LAMP uma opção adequada para testes de SARS-CoV-2 em áreas onde os testes de laboratório clínico não estavam prontamente disponíveis, ou armazenamento e transporte de amostras não era viável, ou em laboratórios que anteriormente não possuíam equipamento de termociclagem PCR.