一、Aumentar a sensibilidade do sistema de reação:

1. Isolar RNA de alta qualidade:

A síntese bem-sucedida de cDNA vem de RNA de alta qualidade.O RNA de alta qualidade deve ser pelo menos completo e livre de inibidores da transcriptase reversa, como EDTA ou SDS.A qualidade do RNA determina a quantidade máxima de informações de sequência que você pode transcrever em cDNA.Um método comum de purificação de RNA é um método de uma etapa usando isotiocianato de guanidina/fenol ácido.Para evitar a contaminação por vestígios de RNase, o RNA isolado de amostras ricas em RNase (como pâncreas) precisa ser armazenado em formaldeído para preservar o RNA de alta qualidade, especialmente para armazenamento a longo prazo.O RNA extraído do fígado de rato foi basicamente degradado após ser armazenado em água por uma semana, enquanto o RNA extraído do baço de rato permaneceu estável após ser armazenado em água por 3 anos.Além disso, transcritos com mais de 4 kb são mais sensíveis à degradação por traços de RNases do que transcritos pequenos.Para aumentar a estabilidade das amostras de ARN armazenadas, o ARN pode ser dissolvido em formamida desionizada e armazenado a -70°C.A formamida usada para preservar o RNA deve estar livre de detritos que degradam o RNA.O RNA do pâncreas pode ser preservado em formamida por pelo menos um ano.Ao se preparar para usar o RNA, você pode usar o seguinte método para precipitar o RNA: adicione NaCl a 0,2 M e 4 vezes o volume de etanol, coloque em temperatura ambiente por 3-5 minutos e centrifugue a 10.000 × g por 5 minutos.

2. Use a transcriptase reversa RNaseH-inativa (RNaseH-):

Os inibidores de RNase são frequentemente adicionados a reações de transcrição reversa para aumentar o comprimento e o rendimento da síntese de cDNA.Os inibidores de RNase devem ser adicionados durante a reação de síntese da primeira fita na presença de um tampão e um agente redutor (como DTT), porque o processo anterior à síntese de cDNA desnatura o inibidor, liberando assim RNase ligada que pode degradar o RNA.Os inibidores da proteína RNase apenas impedem a degradação do RNA pela RNase A, B, C e não impedem a RNase na pele, portanto, tenha cuidado para não introduzir RNase dos dedos, apesar do uso desses inibidores.

A transcriptase reversa catalisa a conversão de RNA em cDNA.Ambos M-MLV e AMV têm atividade RNaseH endógena, além de sua própria atividade de polimerase.A atividade de RNaseH e a atividade de polimerase competem entre si pela fita híbrida formada entre o molde de RNA e o iniciador de DNA ou fita de extensão de cDNA e degradam a fita de RNA no complexo RNA:DNA.O modelo de RNA degradado pela atividade de RNaseH não pode mais servir como um substrato eficaz para a síntese de cDNA, o que reduz o rendimento e o comprimento da síntese de cDNA.Portanto, seria benéfico eliminar ou reduzir bastante a atividade de RNaseH da transcriptase reversa.。

A transcriptase reversa SuperScript Ⅱ, transcriptase reversa RNaseH- MMLV e transcriptase reversa thermoScript, RNaseH- AMV, podem obter mais quantidade e mais cDNA completo do que MMLV e AMV.A sensibilidade de RT-PCR será afetada pela quantidade de síntese de cDNA.O ThermoScript é muito mais sensível que o AMV.O tamanho dos produtos de RT-PCR é limitado pela capacidade da transcriptase reversa de sintetizar cDNA, especialmente ao clonar cDNAs maiores.Comparado com o MMLV, o SuperScripⅡ aumentou significativamente o rendimento de produtos longos de RT-PCR.A RNaseH-transcriptase reversa também tem maior termoestabilidade, de modo que a reação pode ser realizada em temperaturas superiores aos 37-42°C normais.Nas condições de síntese sugeridas, use oligo(dT) primer e 10 μCi de [α-P]dCTP.O rendimento total da primeira fita foi calculado usando o método de precipitação TCA.O cDNA completo foi analisado usando bandas classificadas por tamanho excisadas e contadas em um gel de agarose alcalino.

3. Aumente a temperatura de incubação para transcrição reversa:

Uma temperatura de incubação mais alta ajuda a abrir a estrutura secundária do RNA, aumentando o rendimento da reação.Para a maioria dos modelos de RNA, incubar o RNA e os primers a 65°C sem tampão ou sal, seguido de resfriamento rápido no gelo eliminará a maioria das estruturas secundárias e permitirá que os primers se liguem.No entanto, alguns moldes ainda apresentam estruturas secundárias, mesmo após a desnaturação pelo calor.A amplificação desses modelos difíceis pode ser realizada usando ThermoScript Reverse Transcriptase e colocando a reação de transcrição reversa em uma temperatura mais alta para melhorar a amplificação.Temperaturas de incubação mais altas também podem aumentar a especificidade, especialmente quando primers específicos de gene (GSP) são usados ​​para a síntese de cDNA (consulte o Capítulo 3).Se estiver usando GSP, certifique-se de que a Tm dos primers seja a mesma que a temperatura de incubação esperada.Não use oligo(dT) e primers aleatórios acima de 60°C.Os primers aleatórios requerem incubação a 25°C por 10 minutos antes de aumentar para 60°C.Além de usar uma temperatura de transcrição reversa mais alta, a especificidade também pode ser melhorada transferindo diretamente a mistura de RNA/iniciador da temperatura de desnaturação de 65°C para a temperatura de incubação da transcrição reversa e adicionando uma mistura de reação 2× pré-aquecida (síntese de cDNA hot-start).Essa abordagem ajuda a evitar o pareamento de bases intermoleculares que ocorre em temperaturas mais baixas.A mudança de temperatura múltipla necessária para RT-PCR pode ser simplificada usando um termociclador.

A Tth polimerase termoestável atua como uma DNA polimerase na presença de Mg2+ e como uma RNA polimerase na presença de Mn2+.Pode ser mantido quente a uma temperatura máxima de 65°C.No entanto, a presença de Mn2+ durante a PCR reduz a fidelidade, o que torna a Tth polimerase menos adequada para amplificação de alta precisão, como a clonagem de cDNA.Além disso, Tth tem baixa eficiência de transcrição reversa, o que reduz a sensibilidade e, como a transcrição reversa e a PCR podem ser realizadas com uma única enzima, as reações de controle sem transcrição reversa não podem ser usadas para comparar produtos de amplificação de cDNA com DNA genômico contaminante.Os produtos de amplificação foram separados.

4. Aditivos que promovem a transcrição reversa:

Aditivos, incluindo glicerol e DMSO, são adicionados à reação de síntese da primeira fita, o que pode reduzir a estabilidade da fita dupla do ácido nucleico e desatar a estrutura secundária do RNA.Até 20% de glicerol ou 10% de DMSO podem ser adicionados sem afetar a atividade do SuperScript II ou MMLV.O AMV também pode tolerar até 20% de glicerol sem perda de atividade.A fim de maximizar a sensibilidade do RT-PCR na reação de transcrição reversa SuperScriptⅡ, 10% de glicerol pode ser adicionado e incubado a 45°C.Se 1/10 do produto da reação de transcrição reversa for adicionado à PCR, a concentração de glicerol na reação de amplificação é de 0,4%, o que não é suficiente para inibir a PCR.

5. Tratamento de RNaseH:

O tratamento de reações de síntese de cDNA com RNaseH antes da PCR pode aumentar a sensibilidade.Para alguns modelos, acredita-se que o RNA na reação de síntese de cDNA impeça a ligação dos produtos de amplificação, caso em que o tratamento com RNaseH pode aumentar a sensibilidade.Geralmente, o tratamento com RNaseH é necessário ao amplificar modelos-alvo de cDNA de comprimento total mais longos, como a escherose tuberosa II de baixa cópia.Para este modelo difícil, o tratamento com RNaseH aumentou o sinal produzido por SuperScript II ou cDNA sintetizado por AMV.Para a maioria das reações de RT-PCR, o tratamento com RNaseH é opcional, porque a etapa de desnaturação da PCR a 95°C geralmente hidrolisa o RNA no complexo RNA:DNA.

6. Melhoria do método de detecção de RNA pequeno:

RT-PCR é especialmente desafiador quando apenas pequenas quantidades de RNA estão disponíveis.O glicogênio adicionado como transportador durante o isolamento do RNA ajuda a aumentar o rendimento de pequenas amostras.O glicogênio livre de RNase pode ser adicionado ao mesmo tempo que o Trizol.O glicogênio é solúvel em água e pode ser mantido na fase aquosa com RNA para auxiliar na precipitação subsequente.Para amostras com menos de 50 mg de tecido ou 106 células cultivadas, a concentração recomendada de glicogênio livre de RNase é de 250 μg/ml.

Adicionar BSA acetilado à reação de transcrição reversa usando SuperScript II pode aumentar a sensibilidade e, para pequenas quantidades de RNA, reduzir a quantidade de SuperScript II e adicionar 40 unidades de inibidor de nuclease RNaseOut pode aumentar o nível de detecção.Se glicogênio for usado no processo de isolamento de RNA, ainda é recomendado adicionar BSA ou inibidor de RNase ao usar SuperScript II para reação de transcrição reversa.

二、Aumentar a especificidade de RT-PCR

1. Assíntese CND:

A síntese da primeira cadeia de cDNA pode ser iniciada usando três métodos diferentes, cuja especificidade relativa afeta a quantidade e o tipo de cDNA sintetizado.

O método do primer aleatório foi o menos específico dos três métodos.Os primers recozem em vários locais ao longo da transcrição, gerando cDNAs curtos e de comprimento parcial.Este método é frequentemente usado para obter sequências de terminação 5' e para obter cDNA a partir de moldes de RNA com regiões de estrutura secundária ou com sítios de terminação que não podem ser replicados pela transcriptase reversa.Para obter o cDNA mais longo, a proporção de primers para RNA em cada amostra de RNA precisa ser determinada empiricamente.A concentração inicial de primers aleatórios variou de 50 a 250 ng por 20 μl de reação.Uma vez que o cDNA sintetizado a partir do RNA total usando primers aleatórios é principalmente RNA ribossômico, poli(A)+RNA é geralmente escolhido como molde.

Os primers oligo(dT) são mais específicos do que os primers aleatórios.Ele se hibridiza com a cauda poli(A) encontrada na extremidade 3' da maioria dos mRNAs eucarióticos.Como o RNA poli(A)+ é aproximadamente 1% a 2% do RNA total, a quantidade e a complexidade do cDNA são muito menores do que com primers aleatórios.Devido à sua alta especificidade, oligo(dT) geralmente não requer otimização da proporção de RNA para primers e seleção de poli(A)+.Recomenda-se usar 0,5μg de oligo(dT) por sistema de reação de 20μl.oligo(dT)12-18 é adequado para a maioria dos RT-PCR.O sistema ThermoScript RT-PCR oferece oligo(dT)20 devido à sua melhor estabilidade térmica para temperaturas de incubação mais altas.

Os primers específicos do gene (GSP) são os primers mais específicos para a etapa de transcrição reversa.O GSP é um oligonucleótido anti-sentido que pode hibridar especificamente com a sequência alvo do ARN, ao contrário dos iniciadores aleatórios ou oligo(dT), que se ligam a todos os ARNs.As mesmas regras usadas para projetar primers de PCR se aplicam ao projeto de GSP em reações de transcrição reversa.O GSP pode ser a mesma sequência que o iniciador de amplificação que hibrida com a extremidade 3' do mRNA, ou o GSP pode ser projetado para hibridizar a jusante do iniciador de amplificação reversa.Para alguns sujeitos amplificados, mais de um primer antisense precisa ser projetado para RT-PCR bem-sucedido porque a estrutura secundária do RNA alvo pode impedir a ligação do primer.Recomenda-se o uso de 1 pmol de GSP antisense em uma reação de síntese de primeira cadeia de 20 μl.

2. Aumente a temperatura de incubação para transcrição reversa:

A fim de aproveitar ao máximo a vantagem total da especificidade do GSP, uma transcriptase reversa com termoestabilidade mais alta deve ser usada.As transcriptases reversas termoestáveis ​​podem ser incubadas em temperaturas mais altas para aumentar o rigor da reação.Por exemplo, se um GSP hibrida a 55°C, a especificidade do GSP não será totalmente utilizada se AMV ou M-MLV for usado para transcrição reversa em um baixo rigor de 37°C.No entanto, SuperScript II e ThermoScript podem reagir a 50°C ou mais, o que eliminará produtos não específicos gerados em temperaturas mais baixas.Para especificidade máxima, a mistura de RNA/iniciador pode ser transferida diretamente da temperatura de desnaturação de 65°C para a temperatura de incubação da transcrição reversa e adicionada a uma mistura de reação 2× pré-aquecida (inicialização quente da síntese de cDNA).Isso ajuda a evitar o emparelhamento de bases intermoleculares em baixas temperaturas.As múltiplas transições de temperatura necessárias para RT-PCR podem ser simplificadas usando um termociclador.

3. Reduz a contaminação do DNA genômico:

Uma dificuldade potencial encontrada com RT-PCR é a contaminação do DNA genômico no RNA.O uso de um bom método de isolamento de RNA, como Trizol Reagent, reduzirá a quantidade de DNA genômico contaminando a preparação de RNA.Para evitar produtos derivados do DNA genômico, o RNA pode ser tratado com DNase I de grau de amplificação para remover o DNA contaminante antes da transcrição reversa.A digestão com DNase I foi terminada incubando as amostras em EDTA 2,0 mM durante 10 minutos a 65°C.O EDTA pode quelar íons de magnésio, impedindo a hidrólise do RNA dependente de íons de magnésio em altas temperaturas.

A fim de separar o cDNA amplificado dos produtos de amplificação do DNA genômico contaminantes, podem ser projetados iniciadores de forma que cada um deles se emparelhe com éxons separados.Os produtos de PCR derivados do cDNA serão mais curtos do que os derivados do DNA genômico contaminado.Além disso, um experimento de controle sem transcrição reversa foi realizado em cada modelo de RNA para determinar se um determinado fragmento era derivado de DNA genômico ou cDNA.O produto de PCR obtido sem transcrição reversa é derivado do genoma.