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Várias invenções revolucionárias na história da tecnologia de detecção em minha mente são tecnologia de imunomarcação baseada no princípio de ligação específica de antígeno-anticorpo, tecnologia de PCR e tecnologia de sequenciamento.Hoje falaremos sobre a tecnologia PCR.De acordo com a evolução da tecnologia de PCR, as pessoas habitualmente dividem a tecnologia de PCR em três gerações: tecnologia de PCR comum, tecnologia de PCR quantitativa fluorescente em tempo real e tecnologia de PCR digital.

Ctécnica comum de PCR

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KARY MULLIS (28.12.1944-07.08.2019)

Kary Mullis inventou a reação em cadeia da polimerase (reação em cadeia da polimerase , PCR) em 1983. Dizem que quando ele estava dirigindo sua namorada, de repente teve um lampejo de inspiração e pensou no princípio da PCR (sobre os benefícios de dirigir).Kary Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993. O New York Times comentou: "Altamente original e significativo, quase dividindo a biologia em eras pré-PCR e pós-PCR.

O princípio da PCR: Sob a catálise da DNA polimerase, o DNA da fita mãe é usado como modelo, e o primer específico é usado como ponto de partida da extensão, e o DNA da fita filha complementar ao DNA modelo da fita mãe é copiado in vitro por meio de desnaturação, recozimento, extensão e outras etapas.É uma tecnologia de amplificação de síntese de DNA in vitro, que pode amplificar rápida e especificamente qualquer DNA alvo in vitro.

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Vantagens da PCR comum
1.Método clássico, padrões internacionais e domésticos completos
2.Menor custo de reagentes de instrumentos
3.Os produtos de PCR podem ser recuperados para outros experimentos de biologia molecular
Máquina de PCR Foregene recomendada: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Produtos relacionados: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Desvantagens da PCR comum
1.fácil de poluir
2.operação complicada
3.apenas análise qualitativa
4.Sensibilidade moderada
5.Há amplificação não específica, e quando a banda não específica é do mesmo tamanho da banda alvo, não pode ser distinguida
 
CPCR baseado em eletroforese capilar
Em resposta às deficiências da PCR comum, alguns fabricantes introduziram instrumentos baseados no princípio da eletroforese capilar.A etapa de eletroforese após a amplificação por PCR é concluída no capilar.A sensibilidade é maior, e a diferença de várias bases pode ser distinguida e a amplificação pode ser calculada pelo MAERKER.conteúdo do produto.A desvantagem é que o produto de PCR ainda precisa ser aberto e colocado no instrumento, e ainda há grande risco de contaminação.

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CapilarEeletroforese

 

2. Tecnologia de PCR quantitativo fluorescente em tempo real (PCR Quantitativo em tempo real, qPCR)A PCR quantitativa fluorescente, também chamada de PCR em tempo real, é uma nova tecnologia quantitativa de ácido nucleico desenvolvida pela PE (Perkin Elmer) em 1995. A história do desenvolvimento da PCR quantitativa fluorescente é uma história de lutas comoventes de gigantes como ABI, Roche e Bio-Rad.Se você estiver interessado, pode conferir.Esta técnica é atualmente a técnica de PCR semi-quantitativa mais madura e amplamente utilizada.

Máquina qPCR recomendada: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/

Método de corante fluorescente (SYBR Green I):SYBR Green I é o corante de ligação de DNA mais comumente usado para PCR quantitativo, que se liga não especificamente ao DNA de fita dupla.No estado livre, o SYBR Green emite fluorescência fraca, mas uma vez ligado ao DNA de fita dupla, sua fluorescência aumenta 1.000 vezes.Portanto, o sinal fluorescente total emitido por uma reação é proporcional à quantidade de DNA de fita dupla presente e aumentará com o aumento do produto amplificado.Uma vez que o corante se liga de forma não específica ao DNA de cadeia dupla, podem ser gerados resultados falsos positivos.

Produtos relacionados: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/

Método de sonda fluorescente (tecnologia Taqman): DuranteNa amplificação por PCR, uma sonda fluorescente específica é adicionada ao mesmo tempo que um par de primers.A sonda é um oligonucleotídeo linear, com um grupo repórter fluorescente e um grupo extintor fluorescente, respectivamente, marcados em ambas as extremidades.Quando a sonda está intacta, o sinal fluorescente emitido pelo grupo repórter é absorvido pelo grupo extintor e a detecção Não há sinal fluorescente;durante a amplificação por PCR (no estágio de extensão), a atividade 5'-3' Dicer da enzima Taq irá digerir e degradar a sonda, de modo que o grupo fluorescente repórter e o grupo fluorescente extintor sejam separados, para que o sistema de monitoramento de fluorescência O sinal fluorescente possa ser recebido, ou seja, toda vez que uma cadeia de DNA é amplificada, uma molécula fluorescente é formada, que realiza a sincronização completa do acúmulo de sinais fluorescentes e a formação de produtos de PCR.O método de sonda Taqman é o método de detecção mais comumente usado na detecção clínica.

Produtos relacionados: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/

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Vantagens do qPCR
1.O método está maduro e os equipamentos de suporte e reagentes estão completos
2.Custo médio dos reagentes
3.fácil de usar
4.Alta sensibilidade e especificidade de detecção
 
Desvantagens do qPCR

A mutação do gene alvo leva à falha na detecção.
O resultado da detecção do modelo de baixa concentração não pode ser determinado.
Há um grande erro ao usar a curva padrão para detecção quantitativa.
 
3. Tecnologia de PCR digital (PCR digital, dPCR)
A PCR digital é uma técnica para a quantificação absoluta de moléculas de ácido nucléico.Comparado com o qPCR, o PCR digital pode ler diretamente o número de moléculas de DNA/RNA, que é a quantificação absoluta de moléculas de ácido nucleico na amostra inicial.Em 1999, Bert Vogelstein e Kenneth W. Kin-zler propuseram formalmente o conceito de dPCR.
 
Em 2006, a Fluidigm foi a primeira a produzir um instrumento dPCR baseado em chip comercial.Em 2009, a Life Technologies lançou os sistemas OpenArray e QuantStudio 12K Flex dPCR.Em 2013, a Life Technologies lançou o sistema QuantStudio 3DdPCR, que usa tecnologia de chip microfluídico de nanoescala de alta densidade para distribuir uniformemente amostras para 20.000 células individuais.bem na reação.

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Em 2011, a Bio-Rad lançou o instrumento QX100 dPCR baseado em gotas, que usa tecnologia de água em óleo para distribuir uniformemente a amostra para 20.000 gotas de água em óleo e usa um analisador de gotas para analisar as gotas.Em 2012, a RainDance lançou o instrumento RainDrop dPCR, acionado por gás de alta pressão, para dividir cada sistema de reação padrão em uma emulsão de reação contendo 1 milhão a 10 milhões de microgotículas em nível de picolitro.

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Até agora, o PCR digital formou duas facções principais, tipo de chip e tipo de gota.Não importa o tipo de PCR digital, seus princípios básicos são diluição limitante, PCR de ponto final e distribuição de Poisson.O sistema de reação de PCR padrão contendo modelos de ácido nucleico é dividido uniformemente em dezenas de milhares de reações de PCR, que são distribuídas em chips ou microgotículas, de modo que cada reação contenha o máximo possível de uma molécula de modelo e uma reação de PCR de modelo de molécula única seja realizada.Ao ler a fluorescência, a presença ou ausência do sinal é contada e a quantificação absoluta é realizada após a calibração da distribuição estatística de Poisson.

A seguir estão as características de várias plataformas de PCR digital que usei:

1. PCR digital de gotículas Bio-Rad QX200 Bio-RadO QX200 é uma plataforma de PCR digital muito clássica, o processo básico de detecção: 20.000 amostras são geradas pelo gerador de gotículas As microgotículas de água em óleo são amplificadas em uma máquina de PCR comum e, finalmente, o sinal de fluorescência de cada microgotícula é lido por um leitor de microgotículas.A operação é mais complicada e o risco de poluição é médio.

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PCR digital de microgotas Xinyi TD1Xinyi TD1 é uma plataforma de PCR digital doméstica, o processo básico de detecção: gerar 30.000-50.000 gotas de água em óleo através de um gerador de gotas, amplificar em um instrumento de PCR comum e, finalmente, passar O leitor de gotas lê o sinal fluorescente de cada gota.Tanto a geração quanto a leitura de gotículas nesta plataforma são realizadas em um chip dedicado com baixo risco de contaminação.

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 STILLA Naica chip de micro-gotas PCR digitalSTILLA Naica é uma plataforma de PCR digital relativamente nova.O processo básico de detecção é: adicionar a solução de reação ao chip, colocar o chip no sistema de geração e amplificação de microgotículas e gerar 30.000 microgotículas.Espalhe no chip e a amplificação de PCR é concluída no chip.Em seguida, o chip amplificado é transferido para o sistema de análise de leitura de microgotículas e o sinal fluorescente é lido por meio de fotos.Como todo o processo ocorre em um chip fechado, o risco de contaminação é baixo.

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4. PCR digital do chip ThermoFisher QuantStudio 3D

O ThermoFisher QuantStudio 3D é outra plataforma clássica de PCR digital baseada em chip.Seu processo básico de detecção é: adicionar a solução de reação no espalhador e espalhar a solução de reação uniformemente no chip com 20.000 micropoços através do espalhador., coloque o chip na máquina de PCR para amplificar e, finalmente, coloque o chip no leitor e tire uma foto para ler o sinal fluorescente.A operação é relativamente complicada, e todo o processo é feito em um chip fechado, e o risco de contaminação é baixo.

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5. PCR digital do chip JN MEDSYS Clarity

JN MEDSYS Clarity é uma plataforma de PCR digital tipo chip relativamente nova.Seu processo básico de detecção é: adicionar a solução de reação no aplicador e espalhar a solução de reação uniformemente em 10.000 tubos de PCR fixados no tubo de PCR através do aplicador.No chip microporoso, a solução de reação entra no chip por ação capilar, e o tubo de PCR com o chip é colocado na máquina de PCR para amplificação e, finalmente, o chip é colocado no leitor para ler o sinal fluorescente tirando uma foto.A operação é mais complicada.O risco de contaminação é baixo.

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Os parâmetros de cada plataforma de PCR digital são resumidos da seguinte forma:

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Os indicadores de avaliação da plataforma de PCR digital são: o número de unidades split, o número de canais fluorescentes, a complexidade da operação e o risco de contaminação.Mas o mais importante é a precisão da detecção.Uma maneira de avaliar as plataformas de PCR digital é usar várias plataformas de PCR digital para verificar umas às outras, e outra maneira é usar substâncias padrão com valores precisos.

Vantagens do dPCR
1.Alcançando a quantificação absoluta
2.Maior sensibilidade e especificidade
3.Pode detectar amostras de baixa cópia
Desvantagens do dPCR1. Equipamentos e reagentes caros 2. Operação complicada e tempo de detecção longo 3. Faixa de detecção estreita

Atualmente, as três gerações da tecnologia PCR têm suas próprias vantagens e desvantagens, e cada uma tem seus próprios campos de aplicação, e não é uma relação que uma geração substitua a outra.O avanço contínuo da tecnologia injetou nova vitalidade na tecnologia de PCR, permitindo desbloquear uma direção de aplicação após a outra, tornando a detecção de ácido nucleico mais conveniente e precisa.
Fonte: Dr. Yuan leva você para testes
 
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Horário da postagem: 18 de novembro de 2022